Fundamento. Inmunodifusión radial (MANCINI)

Anti trombina III

Técnica que permite la cuantificación de antigenos; el antigeno se aplica sobre unos pocillos practicados en gel de agarosa que contiene una concentración determinada de antisuero especifico.

El antigeno difunde a través del gel y se combina con el antisuero hasta alcanzar la zona de equivalencia. Aparecen precipitado Ag-Ac en forma de circulo concéntrico (halo) alrededor del pocillo. La inmunodifusión radial se utiliza para estimar la concentración de  proteínas del plasma.

Material.

• Micro pipeta de 10-20μl
• Gradilla
• Soporte micropipeta
• Placa de petri de siembra 20 μl
• Puntas micropipeta

Muestra.

• Plasma pobre en plaquetas

Procesamiento de la muestra.

• Ponemos 20μl de PPP en la placa de siembra
• Tapamos la placa y dejamos reaccionar
• Rotulamos en el lateral de la placa
• Dejamos actuar 2 días
• Si precipita tenemos antitrombina.

Preparación  control anti- antitrombina III

• Preparamos una dilución seriada
• 1/1 50μl pool de plasma
• ½ 50μl suero fisiológico + 50μl del anterior
• ¼ 50μl suero fisiológico + 50μl del anterior
• Ponemos 20μl  de cada una de las diluciones en orden de menor concentración a mayor concentración en la placa de siembra
• Dejamos que actúe 2 días a temperatura ambiente.
• Si precipita tenemos antitrombina III

 Lectura de resultados

• No hay precipitación, pero el halo se mediría igual que con el fibrinógeno.

Preparación del control  para determinación de fibrinógeno

• Pool de plasma  hacemos una dilución seriada
• Suero fisiológico.
• 1/1 200μl de pool  de plasma
• ½  100μl de suero fisiológico + 100μl del tubo anterior
• ¼ 100μl de suero fisiológico + 100μl del tubo anterior
• Ponemos  las diluciones en orden de menor concentración a mayor concentración en la placa de siembra de 5μl
• Dejamos que actúe 2 días a temperatura ambiente.
• Si precipita tenemos fibrinógeno.

Lectura de resultados.

• Ponemos todas las muestras y el control en la placa de siembra de 12 pocillos.
• Dejamos actuar 24h
• Pasado este tiempo se mide el halo que se ha formado con un pie de rey y consultamos el protocolo para saber la concentración del control.
• Concentración del control 7mm = 149,84mg/dl
• Concentración de la muestra 7mm = 749,84mg/dl

^{Fundamento. Inmunodifusion doble Outcherloni}

^{Consiste en colocar en una placa de Petri agar 1,5% al cual luego de solidificar se le realizan perforaciones en forma de pocillos a distancia conveniente y en dichas perforaciones se colocan pequeñas cantidades de Ag. Y Ac. En este caso los reactivos difunden en forma radial a partir del pocillo generando bandas de precipitación cuyas características dependerán de varios factores.}

^{Cuando las concentraciones colocadas en los pocillos estén cerca de la de equivalencia la banda se formará a mitad de distancia entre ellos. Además, nos permite tener idea de los PM  de cada reactivo ya que al tratarse de una difusión radial, la concavidad de la banda estará hacia el lado del pocillo donde se halla colocado el reactivo de mayor PM,  y viceversa,  si ambos PM son semejantes la banda será recta.}

^Material.

^{Micropipeta de 10µl}

^{Varilla de vidrio}

^{Vaso precipitados}

^{Pipeta 10ml}

^Prepipeta

^{Placa petri}

^{Pipeta Pasteur de plastico}

^{Baño termostatado}

^Frigorífico

^{Cámara húmeda}

^Elermeyer

^Termómetro

^Probeta

^Batea

^{Vidrio de reloj}

^Cucharilla

^{Papel filtro}

^Pesa

^Tubos

^{Papel aluminio}

^Reactivo.

^{Agar noble 2g}

^{Agua destilada 200ml.}

^{Suero fisiológico}

^{Colorante negro amido}

^{Ac. Acetico}

^{Solucion de lavado}

^{Muestra y control}

^{Suero láctico}

^{Técnica preparación solución  Agarosa.}

^{Calentamos el material a 70ºc}

^{Medimos el la probeta 200ml de agua destilada}

^{Pesamos 2g de Agar noble en la pesa}

^{Ponemos los 200ml de agua destilada en un vaso de precipitados.}

^{Fabricamos un asa con papel de filtro para manipular el vaso de precipitados sin quemarnos.}

^{Ponemos el agua destilada en el microondas de 3-5 min}

^{Ponemos en el baño termostatado el agua destilada para mantener la temperatura del mismo}

^{Se va añadiendo el Agar noble al agua}

^{Removemos con la varilla de vidrio en el sentido de las agujas de un reloj}

^{Subimos la temperatura del baño termostatado a 100ºc para que se disuelva el Agar mas rápido}

^{Preparamos una cámara de medio húmedo, ponemos agua dentro}

de los tubos de hemólisis para cultivo más o menos 1cm y los ponemos dentro de la batea en posición horizontal.

^{Ponemos 7-8ml de solución Agarosa en cada placa de petri.}

^{Ponemos las placas de petri en cámara de medio húmedo}

^{Una vez puestas las placas de petri en medio húmedo se tapara con papel de aluminio y se pondrá en nevera en posición horizontal 24h}

^{Troquelamos las placas de petri sirviéndonos de la plantilla con una pipeta Pasteur de plástico.}

• ^Reidratamos
• ^{Preparamos la dilución al 1/10 100ml de colorante y 900ml de agua destilada}

^{Dilución del control}

^{1/1 suero láctico}

^{½  1 gota de suero fisiológico + 1 gota de suero láctico}

^{1/3  2 gotas de suero fisiológico + 1 gota de suero láctico}

^{Cargamos la placa de petri de la siguiente manera:}

^{Una vez cargada se pone en cámara de medio húmedo}

^{Lectura de resultados.}

• ^{Medimos la concentración del Ag midiendo desde el pocillo hasta la linea cuanta mas distancia haya mas concentración hay.}
• ^{C1= 1/1 5mm}
• ^{C2= ½ 4mm}
• ^{C3= 1/3 4mm}
• ^{M1= 5mm}
• ^{M2= 5mm}
• ^{B= 0mm}
• ^{Ponemos las placas en una batea y las rociamos con solución de lavado}
• ^{homogeneizamos en homogeneizador eléctrico unos 20 minutos aunque deberíamos dejarlo}
• ^{recuperamos la solución de lavado.}
• ^{Ponemos colorante en cada placa y dejamos actuar de 3-5 minutos}
• ^{Decantamos las placas en un recipiente.}
• ^{Ponemos solución decolorante}
• ^{Representamos las concentraciones en una grafica}

^{Fundamento.coombs directo}

^{Enfrentar hematíes del paciente al suero de coombs específico, para determinar si existe o no autoanticuerpos fijados en la membrana eritrocitaria, su presencia se manifiesta por la aglutinación de los hematíes en el fondo del tubo.}

^Material.

• ^{tubos de hemólisis}
• ^centrifuga
• ^{pipetas Pasteur}
• ^{baño termostatado}
• ^gradilla
• ^rotulador

^Reactivos.

• ^{Suero fisiológico}
• ^{Suero de coombs anti-IGg}
• ^{suero de coombs anti-C3-C4}
• ^{suero anti-D incompleto (IgG)}
• ^{solución de sacarosa 60g/l}
• ^NaCl
• ^{Hematíes normales no sensibilizados}
• ^{Hematíes Rh D+}
• ^{Sangre del grupo 0 sin anticoagulante}

^Muestra.

• ^{Hematíes del paciente resuspendidos al 2-5%}

^Técnica.

• ^{Rotular los tubos con las letras C1, C2, C3, C4, C5, C6, P1, P2.}
• ^{En el tubo C1 poner 1 gota de hematíes normales no sensibilizados y 1 gota de suero de coombs anti-IgG}
• ^{En el tubo C2 poner 1 gota de hematíes normales no sensibilizados y 1 gota de suero de coombs  anti-C3-C4.}
• ^{En el tubo C3 poner 1 gota de hematíes sensibilizados con IgG y una gota de suero de coombs anti-IgG}
• ^{En el tubo C4  poner 1 gota de hematíes sensibilizados  con complemento y 1 gota del suero de coombs anti-IgG}
• ^{En el tupo P1 poner 1 gota de hematíes del paciente y 1 gota de suero de coombs anti-IgG}
• ^{En el tubo P2 poner 1 gota de los hematíes del paciente y 1 gota del suero de coombs anti-C3-C4}
• ^{Centrifugar los tubos a 3000 rpm 45 seg}

^{Lectura de resultadosDespegar el sedimento hematico de todos los tubos.}

^{Los tubos que presenten aglutinación indican resultado positivo, Ac sobre la membra eritrocitaria.}

^{El los tubos C1 y C2 no dede aparecer aglutinación puesto que son controles negativos.}

^{Los tubos C3 y C4 son controles + siempre deben presentar aglutinación.}