Inoculación de Placas (Siembra en Estría»

Materiales:

• Placas Petri
• Aguja de siembra
• Mechero Bunsen
• Muestra bacteriana

Procedimiento:

1. Limpiar y desinfectar el puesto de trabajo.
2. Rotular las placas donde se sembrará.
3. Tomar una muestra de las bacterias con la aguja de siembra.
4. Trabajar en asepsia, manteniendo la distancia con la placa y el mechero Bunsen encendido.
5. Levantar la tapa de la placa Petri entre 45-60º.
6. Dividir la placa en dos y sembrar cada mitad.
7. Restregar en forma de estría.
8. Incubar durante 24 horas.
9. Realizar un frotis con lo obtenido.

Recomendaciones:

• Trabajar en una zona de asepsia.
• Mantener la distancia correcta al mechero.
• Abrir la tapa entre 45 y 60º.
• Esterilizar las asas de Ni-Cr al rojo vivo antes y después de la inoculación.
• Enfriar el asa antes de tomar la muestra.
• Depositar las asas de plástico en hipoclorito de sodio al 10%.

Tinción de Endospora»

Materiales:

• Portaobjetos
• Algodón
• Alambre
• Vasos de precipitados
• Alcohol
• H2O
• Muestra de medio sólido
• Solución salina
• Asa de siembra
• Mechero Bunsen
• Verde Malaquita
• Safranina

Procedimiento:

1. Limpiar y desinfectar el puesto de trabajo.
2. Enrollar algodón apretado en la parte curvada del alambre.
3. Preparar dos vasos de precipitados: uno para el alcohol y otro con H2O.
4. Realizar el frotis de un medio sólido, poniendo una gota de solución salina sobre el portaobjetos.
5. Tomar un poco de carga con el asa de siembra y homogeneizar sobre el portaobjetos.
6. Dejar secar y fijar con el mechero Bunsen.
7. 1ª tinción: Emplear la tinción de Gram para distinguir entre Gram + (violeta) y Gram – (rosa).
8. 2ª tinción: Emplear la tinción de esporas con Verde Malaquita y Safranina para diferenciar entre esporas (verde) y bacilos (rosa).
9. Cubrir con Verde Malaquita y calentar con la antorcha hasta que emita vapores blancos.
10. Lavar con agua destilada y añadir Safranina.
11. Observar con el microscopio con el objetivo de inmersión.

Visualización de Hongos Filamentoso»

Materiales:

• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Azul de lactofenol
• Muestra fúngica
• Asa de siembra
• Espátula micológica

Procedimiento:

Visualización tomando muestra con el asa o espátula micológica:

1. Limpiar y desinfectar el puesto de trabajo.
2. Rotular los portaobjetos.
3. Poner una gota de azul de lactofenol sobre el portaobjetos.
4. Tomar la muestra con el asa de siembra o espátula micológica.
5. Depositar la muestra sobre la gota de azul de lactofenol.
6. Colocar el cubreobjetos con la técnica de los 45º.
7. Visualizar a 4x, 10x y 40x.

Visualización con técnica de Scotch:

preparamos un portaobjeto limpio y desengrasado, sobre el portaobjetos ponemos una gota pequeña de azul de lactofenol y con esta técnica, cortamos un trozo de cinta adhesiva transparente. Con la cara adhesiva del trozo de cinta orientado hacia el exterior y sujetado con los dedos, tocamos la colonia fúngica. Ponemos sobre la gota de azul de lactofenol la cinta adhesiva, haciendo coincidir la muestra con la gota.Muy importante evitar la formación de arrugas y burbujas. Visualizamos a 4x ,10x y 40x, sin llegar a 100x. Para la realización de esta técnica debemos trabajar en una zona de asepsia, a la distancia correcta al mechero, con la espátula o asa de siembra esterilizadas al rojo vivo , antes y después de la toma de la muestra. Y antes de tomar la muestra de la placa o del alimento, debemos comprobar que el asa de siembra se ha enfriado tocando en una zona donde no haya crecimiento fúngico. Agar MacConkey: Fermentadores de lactosa: Colonias rosadas a rojas. ▫ No fermentadores de lactosa: Colonias trasparentes (incoloras). ▫ La presencia de sales biliares y cristal violeta: Inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram+. Lectura:  Colonias lactosa negativa: Incoloras (no hay fermentación de la lactosa) Ej: Salmonella, Shigella, Pseudomonas Colonias lactosa positiva : Rosa/rojo Ej: Escherichia coli (rosa/roja) 

Agar XLD: Medio selectivo y diferencial.Se utiliza para aislamiento y diferenciacion de gram negativas en alimentos y muestras clinicas. Especies: Shigella y salmonella. Indicador: rojo fenol, la presencia de azucar diferencia las colonias por color, si fermentan color amarillo y si no fermentan incoloro.
 

MICROCULTIVO: Antes de comenzar realizamos el procedimiento de limpieza. Preparamos una placa Petri con un círculo de papel de filtro en el fondo, sobre el papel de filtro ponemos un portaobjetos limpio. De una placa de agar. Cortamos un cuadrado de 1 × 1 ‘5 cm 2. Con la hoja del bisturí ,sacamos el cuadrado de Agar , y lo ponemos sobre el portaobjetos.Inoculamos el Agar en cinco puntos y  con el  asa de siembra cogemos un inóculo clavando el asa en el Agar.Cogemos una muestra de la base del Agar y después la sembramos poniéndolo en el cuadrado. Sobre la siembra ponemos un cubreobjetos. Ahora humedecemos el papel del filtro con agua destilada y cerramos la placa con  Parafilm y la incubaremos durante 4-7 días a 25 °C. El hongo crecerá sobre un portaobjetos, flameamos las pinzas y retiramos el cuadrado de Agar con cuidado para conseguir que las estructuras estén  lo más intactas posibles. Lo pondremos sobre un portaobjetos con una gota de colorante azul de lactofenol o azul de metileno y de este modo observaremos las hifas intactas, facilitando su correcta identificación. Podemos observar la preparación a 40x para poder ver las estructuras, pero si queremos verla a más aumentos, es decir, 100x, podemos fijar la preparación con esmalte transparente pero para ello dejaremos que seque y pondremos aceite de inmersión sobre el cubreobjetos. VISUALIZACIÓN LEVADURAS : realizamos el procedimiento de limpieza. Cogemos la muestra con el asa de siembra, previamente esterilizada, la ponemos en el portaobjetos .Después le ponemos una gota de solución salina, realizando lo mismo que en anteriores prácticas.Flameamos el asa de siembra, le damos golpecitos con el vaso de precipitados para que se enfríe un poco y cogemos una gota, que luego mezclaremos con la muestra y esparciremos sobre el portaobjetos.Cuando ya haya secado,lo fijamos realizando el frotis.

Después realizaremos la tinción de Gram, utilizando cristal violeta 1 minuto,luego lugol 1 minuto,alcohol acetona 15-25 seg y por último safranina 5 minutos.Dejamos secar en la gradilla y cuando esté seco podremos verlo al microscopio.

CÁLCULO DE LAS UFC: Antes de comenzar realizamos el procedimiento de limpieza, lavándonos las manos  y la desinfección del campo de trabajo.Una vez realizado, ponemos papel de filtro en la mesa y ya podemos empezar a preparar los materiales que necesitemos para cada práctica.Cogemos el material y ponemos 9ml en 6 tubos de ensayo cortos (1-6) y 2 ml en 1 tubo (M) con solución salina. En un folio pintamos líneas con rotulador con la ayuda de una regla para la comprobación del 0,5. Con pipeta esterilizada y propipeta cogeremos la carga bacteriana de una de las prácticas de las colonias que tenemos. Calentamos el asa de siempre en el mechero Bunsen y prepararemos el inóculo.Ponemos la carga bacteriana en la (M) (solución madre) donde tenemos 2 ml. Removemos en el vortex. Debido a que no teníamos el objetivo propuesto,añadimos solución salina, en nuestro caso,3 ml más , al final tenemos en la (M) = 5 ml. Consiguiendo 0,5 de turbidez. Comparamos  con las líneas negras que hemos hecho en una hoja en blanco.Después realizamos la fórmula n*colonias x inversión de dilución/ 5 ml. Ponemos de la (M) al tubo de ensayo 1 y removemos en la máquina Vortex. Después  añadimos de la (1) a la (2) y removemos y así repitiendo todo el proceso hasta el 6º tubo . Pasamos la muestra de cada uno de los tubos de ensayo a la placa Petri con el Agar. Echamos 0,1 ml en el centro de la placa. Empezando por la placa menos diluida en este caso la (6) hasta la (1). Con el asa de siembra removemos la muestra desde la (6) a la (1) en ese orden y realizamos las incubamos. Microorganismos ambientales: a 25ºC ▪ Microorganismos patógenos: a 37ºC. Recuento de UFCs: Seleccionaremos el recuento de aquella placa donde el crecimiento se encuentre entre 30 y 300 colonias. (𝑵º 𝒄𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊𝒂𝒔 ∗ 𝒊𝒏𝒗.𝒇𝒂𝒄𝒕.𝒅𝒊𝒍)/ 𝟐 = UFC/mL de suspensión original 

• Contaminantes medioambientales: Environmental contaminants • Residuos de plaguicidas: Pesticide residues • Metales pesados: Heavy metals • Nitratos: Nitrates • Nitritos: Nitrites • Cadena alimenticia: Food chain • Bioacumulativo: Bioaccumulation • Fotooxidación: Photooxidation • Temperatura de almacenaje: Temperature of storage • Contaminación inicial: Initial contamination • Conservas caseras: Homemade preserves • Buenas prácticas de higiene: Good Hygiene Practices • Almacenamiento de alimentos: Food storage • Elaboración de alimentos: Food elaboration • Conservación de alimentos: Food preservation • Vida útil (de un alimento): Shelf live (of food) • Características organolépticas: Organoleptic characteristics • Tratamiento térmico: Heat treatment • Deshidratación: Dehydration • Ahumado: Smoked • Atmófera protectora: Protective atmosphere • Envasado al vacío: vacuum packaging • Liofilización: Freeze-drying • Alimento irradiado: Irradiated food • Pasteurización: Pasteurization • Esterilización: Sterilization

XLD: medio de color. amarillo=fermentacion de azucares (xilosa) y si es rojo = no hay fermentacion. Sirve para aislar gram negativos como Shigella( puntos rojos) y Salmonella (rojo y por el medio negro).

McConkey es por fermentacion de la lactosa. Lactosa positivo=placa rosa o roja y hay presencia de enterobacter, E.coli y Klepsiella. Lactosa negativo= no hay fermentacion (incolora).