Hibridación o Annealing

Temperatura variable de 30-65ºC (a mayor Tª, mayor especificidad, varía en función del cebador). Contra mayor tamaño del cebador, mayor tiempo de unión (más puentes de H): Sucede tras la desnaturalización a altas Tª (rotura de puentes de H entre bases nitrogenadas obteniendo 2 cadenas monocatenarias), al producirse el enfriamiento el ADN puede volver a formar puentes de H entre bases complementarias de manera espontánea, así podemos añadir fragmentos de ADN complementarios exógenos al genoma (cebadores, sondas). Se une el cebador o la sonda (contiene fluoróforo en la PCR en tiempo real) a la cadena de ADN monocatenaria por complementación de bases específica y establece grupo OH libre en 3´ donde la polimerasa en la fase de extensión o elongación comienza a añadir nucleótidos. Cada cebador tiene una secuencia complementaria distinta, de ahí la importancia de su elección según el fragmento que se quiera amplificar. Uso: PCR con cebadores y sondas (PCR tiempo real), clonación basada en células (tamaño de los fragmentos mayores a los que permite la sensibilidad PCR) y en transferencia a membranas.

Diseño de Primers

Propiedades:

• Debe ser específico (unión por complementariedad de bases) del fragmento de ADN, tras este se efectuará la fase de elongación en extremo 3´ por la polimerasa.
• No se debe unir a otros fragmentos.
• Tiene que tener afinidad suficiente para no sufrir desnaturalización en fase de elongación por el aumento de Tª.
• Aumenta la especificidad con el aumento de tamaño (mayor número de bases complementarias), así como la afinidad y el tiempo de hibridación.
• El extremo 3´ donde se sitúa el OH libre que marca el inicio de la acción de la polimerasa debe estar libre.

Composición de bases:

Contenido GC 40 a 60% y distribución uniforme de los cuatro nucleótidos.

Marcaje de Sondas

La sonda posee una región complementaria que varía entre específicas (todo) y no específicas (región bucle). Contiene fluoróforo unido al extremo 5´ y el quencher al 3´. También se puede marcar con señal en extremo cadena ADN.

Electroforesis en Geles

Técnica de separación de moléculas (ADN, ARN, proteínas) según tamaño y carga eléctrica (tamización por gel) en una cámara de electroforesis. Puede ser tras una PCR o por fragmentos formados por endonucleasas de restricción. Esto es posible gracias a una matriz porosa por la que difunden las moléculas con carga atraídas por fuerzas eléctricas opuestas del electrodo, según el tamaño varía la velocidad de difusión y el avance por el gel que ofrece resistencia.

Tipos de Gel

a. Poliacrilamida: Solo sirve para fragmentos cortos de ADN, tiene más precisión en los resultados.

b. Agarosa: Formado por polisacárido en disolución buffer. Para poder ver el avance de las partículas el gel o los fragmentos deben estar teñidos:

• Tinción con SYBR: Agente intercalante más seguro.
• Bromuro de etidio: Agente intercalante que emite fluorescencia bajo luz UV.

Parámetros Componentes Analizables

Moléculas ADN doble cadena: Se utiliza por ejemplo tras una PCR. Las moléculas de ADN tienen estructura lineal estable y carga negativa, es atraído por fuerzas eléctricas positivas del electrodo.

Moléculas ARN: Posee carga negativa (atraído por electrodo positivo) pero son monocatenarias por lo que pueden formar estructuras alternas que dificultan la difusión por el gel. Se utiliza glioxal para evitar estas estructuras.

Proteínas: No tienen carga estable, varía según aa. Pueden formar estructuras variables que dificultan difusión por gel. Se utilizan alcoholes para prevenir formación estructuras variables, y soluciones iónicas (dodecil sulfato de sodio) o diferentes pH para dar carga negativa a las proteínas.

Transferencia a Membranas

Tras la electroforesis se obtienen las partículas separadas según carga y tamaño, se transfieren a una membrana por atracción eléctrica para su visualización y análisis. Se utilizan diferentes métodos según si analizamos ADN, ARN o proteínas. Uso: Identificación de los fragmentos deseados (contienen gen, alelo) por detección por fluorescencia mediante hibridación de sondas, o proteínas mediante formación inmunocomplejos.

Hibridación Southern Blot con ADN

Se requieren fragmentos pequeños, por lo que se deben digerir antes de la electroforesis con endonucleasas de restricción.

Proceso:

1. El gel de electroforesis se introduce en disolución alcalina para desnaturalizar hebras ADN (romper enlaces puentes H entre bases complementarias formando fragmentos monocatenarios) y que puedan salir fácilmente del gel, se lava con disolución buffer como la de la electroforesis.
2. Se coloca membrana nitrocelulosa encima del gel y por atracción electrostática (tiene carga positiva y el ADN negativa) se transfieren el ADN haciendo una copia de la electroforesis.
3. Se realiza hibridación de la membrana con disolución que contiene sondas (contienen fluoróforo) complementarias específicas de los fragmentos de estudio. Se lava la membrana para eliminar sondas que no se unen.
4. Los fragmentos que han sido marcados se observará fluorescencia.

Hibridación Northern Blot con ARN

No se requiere digestión con endonucleasas ya que son fragmentos pequeños.

Proceso:

Igual que en ADN.

Uso:

Identificación de los fragmentos deseados por detección por fluorescencia mediante hibridación de sondas, y la cantidad de ARN en diferentes tejidos.

Inmunotransferencia Western con Proteínas

No se requiere menor tamaño, solo el tratamiento recibido en electroforesis (alcoholes previenen formación estructuras y solución iónica para dar carga negativa).

Proceso:

1. Se coloca membrana nitrocelulosa encima del gel y por atracción electrostática (tiene carga positiva y las proteínas negativas) se transfieren las proteínas haciendo una copia de la electroforesis.
2. Se realiza conjugación con anticuerpos específicos para formar inmunocomplejos que se quedan unidos a la membrana, se lava para limpiar Ac no unidos.
3. Para visualizar la unión proteína Ac se utiliza disolución con enzima cromogénica que reacciona en presencia del Ac y produce coloración.

Uso:

Identificación de proteínas para saber su tamaño tras la electroforesis y su patrón de expresión del ARN precursor.

Secuenciación de Nucleótidos DNA

Análisis de un fragmento de ADN para averiguar el orden de los nucleótidos que contiene. También alteraciones en nucleótidos (no habrá complementario) ya que no se secuenciará ese nucleótido. Se pueden comparar luego distintos fragmentos para identificar polimorfismos. Si aparecen dos nucleótidos en la misma posición (misma longitud de fragmento o pico) es que el individuo es heterocigoto para ese nucleótido, hay un polimorfismo.

Método de Terminación de la Cadena o Método Didesoxi (Sanger)

Utiliza la electroforesis.

Procedimiento:

1. El fragmento de ADN a secuenciar se mezcla con ADN polimerasa, los 4 tipos de nucleótidos (dNTP) y un primer o cebador (específico del fragmento que se quiere replicar).
2. Esta mezcla se divide en 4 (una por cada tipo de nucleótido) y a cada una se le añade un tipo de didesoxiribonucleótidos trifosfato (ddNTP) que no tienen grupo OH en extremo 3´ sino un H por lo que la polimerasa no puede continuar la replicación tras estos nucleótidos.
3. Comienza la replicación a partir del extremo 3´ del OH libre del cebador y la polimerasa va añadiendo nucleótidos.
   1. Llegado un punto se introduce de forma aleatoria un ddNTP complementario a su nucleótido en la cadena base y se detiene la replicación.
   2. Esto ocurre en cada una de las 4 reacciones (cada reacción tendrá fragmentos con mismo nucleótido de terminación), obteniendo diferentes fragmentos de distintos tamaños correspondientes a la separación entre el cebador y cada uno de los nucleótidos de la cadena.
4. Se realiza electroforesis o separación por tamaños y carga de los diferentes fragmentos obtenidos en gel de poliacrilamida.
5. Observando lo que avanza cada fragmento podemos extrapolar el orden de los nucleótidos; los fragmentos más pequeños avanzarán más, corresponden a los nucleótidos cercanos al cebador.
6. También se utilizan ddNTP marcados con fluoróforos (secuenciador automático), permiten realizar 4 reacciones juntas (todos ddNTP en misma reacción) y luego en electroforesis identificar el orden de nucleótidos según la fluorescencia captada por un láser.

Pirosecuenciación

Utiliza reacción cadena enzimática que libera luz según se incorporan los nucleótidos.

Procedimiento:

1. El fragmento de ADN a secuenciar se mezcla con enzimas (ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa), con los 4 tipos de nucleótidos y un primer o cebador (específico del fragmento que se quiere replicar).
2. Comienza la replicación a partir del extremo 3´ del OH libre del cebador y la polimerasa va añadiendo nucleótidos (dNTP) y liberando en cada uno pirofosfato inorgánico (PPi).
   1. La ATP sulfurilasa cataliza conversión PPi en ATP en presencia de APS (adenosin fosfosulfato).
   2. La luciferasa cataliza la conversión de luciferina oxiluciferina en presencia de ATP.
3. Esto libera energía en forma de luz que es detectada por el pirosecuenciador.
   1. Cada tipo de nucleótido libera una cantidad diferente de PPi, lo que varía la intensidad de la señal lumínica.
4. Si no se añade un nucleótido no se libera luz.
   1. La apirasa degrada nucleótidos no añadidos.

Uso:

Averiguar orden nucleótidos, detección metilaciones de nucleótidos (no se añade nucleótido) y SNP.

Método de Clonación ADN Basado en Células

Permite amplificar fragmentos de ADN (genes) mayores de 1500-2000 pb que no se pueden procesar con la PCR. Para ello se utiliza la tecnología del ADN recombinante, se combinan fragmentos de diferentes orígenes mediante enzimas de restricción y ADN ligasa. El nuevo fragmento contiene el vector unido al fragmento que se quiere amplificar (inserto), se introduce en una célula o bacteria donde se replica.

Usos:

• Amplificar fragmento ADN y obtener muchas copias.
• Aislar un fragmento de ADN del resto.

Genoteca

Obtención de los fragmentos de ADN de interés para introducirlos luego en vector. Conjunto de fragmentos diferentes copias del genotipo (conjunto de genes de un individuo).

Tipos:

1. Genoteca genómica: Basada en la digestión con endonucleasas de restricción del material genético de una célula obteniendo muchos fragmentos. Se eligen los fragmentos que contienen el fragmento de interés y se introducen en un vector para su posterior clonación en células.
2. Genoteca de cDNA: Basada en la transcripción del material genético a ARNm, y este mediante retrotranscripción inversa a ADN complementario (no contiene intrones o regiones no codificantes). Se eligen los ADNc que contienen el fragmento de interés y se introducen en un vector para su posterior clonación en células. Como ventaja el ADNc no puede ser eliminado por la bacteria tras la implantación por el vector debido a la ausencia de intrones.

Vectores

Cualidades indispensables:

Poseen un marcador (secuencia codificante de genes) para diferenciarlos en la célula, tienen origen replicación independiente (ORI) del material genético de la célula, contiene diferentes secuencias de reconocimiento utilizadas por las distintas enzimas de restricción para cortar y añadir el fragmento deseado.

Plásmidos

Son cadenas de ADN circulares presentes en bacterias. Permite añadir fragmento de 15000 pb. Marcadores plásmidos: Región codificante para un gen contenida en el plásmido.

a. Gen Amp: Permite identificar bacterias con plásmido (no si es o no recombinante). Codifica la resistencia al antibiótico ampicilina y permite proliferación. Si añadimos antibiótico al medio las bacterias que proliferen tendrán el plásmido.

b. Gen lacZ: Permite identificar bacterias con plásmido recombinante. Codifica la producción de enzima β-galactosidasa que degrada X-Gal presente en el medio y produce tonalidad azul. Cuando se inserta el fragmento de ADN en el sitio de restricción el gen se altera y deja de producir la enzima, por lo que no se produce coloración. Si añadimos Xgal al medio las bacterias que no lo degraden (blancas) tendrán el plásmido recombinante.

Proceso:

1. Las enzimas de restricción cortan el plásmido (en sitio restricción) y el fragmento de ADN a amplificar, ambos se aparean espontáneamente por complementariedad de bases (puentes de H) y la ADN ligasa une nucleótidos por enlaces fosfodiéster.
2. Así se forma el plásmido recombinante.
3. Se introduce en la bacteria dado que esta lo capta del medio (transformación). Ahí se replica y se obtienen copias.

Otros Vectores

a. Bacteriófagos: El fragmento a replicar se inserta en virus, estos se reproducen e infectan a la bacteria insertando el fragmento. Permite añadir fragmentos de 23000 pb.

b. Cósmido: Formado por cápsulas de virus vacías en las que se introducen (contiene fragmento ADN a replicar), ahí se replican. Luego ataca a la bacteria e inserta plásmidos. Permite añadir fragmentos de 44000 pb.

c. Cromosoma artificial bacteriano: Formado por plásmido F que controla replicación en bacterias al que se le introduce el fragmento a amplificar. La bacteria no puede introducirlo por transformación por su elevado tamaño, se introduce por electropulsación, ahí se replica. Fragmentos de 300.000 pb.

d. Cromosoma artificial levadura: Usado para introducir fragmento ADN (600.000 pb) deseado en célula eucariota en vez de bacteria. En la división celular se segrega como un cromosoma más.

e. Vectores de expresión: Se utilizan cuando en vez de replicar un determinado fragmento de ADN se busca producir una proteína en masa. Para ello a parte de contener el marcador (secuencia codificante de genes), el origen de replicación y los sitios de restricción contiene secuencias para la transcripción y traducción (así como la regulación) del fragmento deseado.

Colony Blot

Permite identificar qué colonia contiene el fragmento de ADN (introducido con el vector) que nos interesa. Parecido a la hibridación southern blot con ADN en transferencia de membranas.

Procedimiento:

1. Las bacterias que sabemos que contienen el ADN recombinante se siembran en una placa.
2. Cada bacteria proliferará y formará una colonia.
3. Se coloca membrana de nitrocelulosa encima de la placa a la que se adhieren bacterias de cada colonia haciendo una copia.
4. Se realiza hibridación de la membrana con disolución que contiene sonda (contienen fluoróforo) complementaria específica del fragmento de interés. Se lava la membrana para eliminar sondas que no se unen.
5. Los fragmentos que han sido marcados se observará fluorescencia, pudiendo identificar las colonias que contienen el fragmento deseado.

Obtención de Fármacos de Origen Biotecnológico

La mayoría de los fármacos tradicionales son compuestos orgánicos que contienen un grupo limitado de grupos funcionales.

Los fármacos obtenidos mediante procesos biotecnológicos son, sobre todo, las proteínas terapéuticas que pueden contener cientos de aminoácidos.

A los pacientes no les importa si el fármaco ha sido obtenido por medios químicos o biotecnológicos: SÓLO QUE FUNCIONE.

Los procesos de producción biotecnológicos son más complejos que los procesos tradicionales de producción de fármacos.

La mayoría de los fármacos elaborados mediante métodos biotecnológicos son proteínas que son altamente sensibles a cambios en su entorno.

Su estructura depende de diversas interacciones, a menudo débiles, entre los aminoácidos.

Estas interacciones están óptimamente coordinadas sólo en un margen estrecho de condiciones ambientales que corresponden precisamente a aquellas que se encuentran en el organismo del cual derivan las proteínas.

Incluso cambios relativamente pequeños en la temperatura, concentración de sales o pH de la solución pueden dañar la estructura y por tanto neutralizar la función de la proteína.

La mayoría de estas moléculas actúan como mensajeros químicos en el cuerpo.

Las células diana que reciben y traducen las señales tienen receptores especiales en su superficie en las cuales el correspondiente mensajero químico encaja perfectamente.

Si la estructura tridimensional del mensajero químico se altera ligeramente, la molécula no será reconocida por su receptor y será inactiva.

La situación es similar con otro grupo de proteínas terapéuticas: los anticuerpos.

En la biosíntesis natural de proteínas, en las células del cuerpo, una serie de enzimas se encargan de la correcta formación de las estructuras proteicas.

La producción de proteínas no puede realizarse mediante métodos químicos.

La mayoría de fármacos obtenidos mediante la aplicación de la biotecnología se producen en cultivos de microorganismos y células de mamíferos.

Cuando las sustancias constan de varias proteínas o sustancias que tienen que ser modificadas por adición de grupos no proteicos como cadenas de azúcares se deben emplear cultivos de células de mamífero.

Las células son organismos vivos y reaccionan incluso a pequeños cambios en su ambiente, no sólo a factores controlables como en la síntesis química convencional sino también a la solución de nutrientes y cualquier objeto o sustancia que entre en contacto con ellas.

Cada planta de producción biofarmacéutica es esencialmente única.

Los laboratorios y las empresas biotecnológicas trabajan con líneas celulares específicas que están muy estudiadas y susceptibles de estandarización.

Los investigadores biotecnológicos insertan genes estructurales y de control en las células de las líneas para producir el fármaco.

La nueva línea celular creada se trata normalmente como un secreto empresarial.

Se guardan como un banco celular que se conserva a bajas temperaturas (en nitrógeno líquido a -196°C para conservación a largo plazo).

Fases del Proceso

1. Cultivo: Las células se transfieren del banco celular criogénico a un medio líquido con nutrientes que les permiten reproducirse.

La longitud de este paso depende del tipo de célula usada.

En condiciones favorables las células bacterianas se dividen una vez cada 20 minutos y las células de mamíferos se dividen una vez cada 24 horas.

Durante la fase de crecimiento el cultivo celular se transfiere a recipientes de cultivo de mayor tamaño progresivamente.

1. Fermentación: El medio de cultivo contiene las sustancias necesarias para la síntesis de la proteína terapéutica deseada.

El medio de cultivo contiene alrededor de 80 constituyentes diferentes en esta etapa.

Los recipientes en los que tiene lugar la fermentación tienen capacidades de unos 10000 litros (limitaciones tecnológicas y biológicas).

1. Purificación:

Si las células cultivadas secretan el producto en la solución ambiente, se separan las células del medio de cultivo (centrifugación, filtración) y el producto se aisla tras varios pasos de purificación.

Si el producto permanece en el interior de las células, las células se aislan, digieren y los desechos celulares se separan de la solución junto con el producto.

El rendimiento de procesos de bioproducción es generalmente menor que la síntesis química.

Tanto la purificación como el análisis de de cada lote de producto final duran varias semanas. Se requiere un nivel de pureza de 99,9 % para aprobación.

1. Formulación.

Las proteínas sensibles se deben convertir en formas farmacéuticas estables y deben ser guardadas, transportadas y finalmente administradas en condiciones de seguridad.

A lo largo de estos pasos se debe salvaguardar la integridad estructural de la molécula para mantener su eficacia.

La naturaleza sensible de muchos fármacos de origen biotecnológico hace que se deban emplear soluciones especiales en las que el producto puede ser criogénicamente congelado y preservado.

La forma de administración de los mismos suele ser a través de soluciones inyectables (evita pH ácido de estómago y pueden atravesar la pared intestinal).

Ejemplo de Método de Producción de Insulina

El primer producto génico humano manufacturado utilizando DNA recombinante y con licencia para usos terapéuticos fue la INSULINA HUMANA. N terminal

La subunidad A tiene 21 aminoácidos y la subunidad B tiene

Se utilizaron oligonucleótidos para construir genes sintéticos de las subunidades A y B (63 y 90 nucleótidos respectivamente).

La molécula de insulina madura consiste en dos cadenas polipeptídicas (cadenas A y B) unidas por puentes disulfuro.

Cada oligonucleótido sintético se insertó en un vector en una posición adyacente al gen que codifica la forma bacteriana de la enzima p-galactosidasa.

El producto es un polipéptido de fusión: secuencia aminoacídica de p-galactosidasa unida a la de una de las subunidades de la insulina.

Se purifican las proteínas de fusión de extractos bacterianos y se tratan con bromuro de cianógeno: corta la proteína de fusión produciendo p-galactosidasa y una de las subunidades de la insulina.

Cuando se mezclan las dos subunidades se unen espontáneamente formando una molécula de insulina intacta y activa.

Modificaciones de Proteínas

El incremento en la eficacia de las proteínas se puede conseguir con la ayuda de modificaciones específicas.

Un método para inducir modificaciones en proteínas es conocido como PEGILACIÓN.

El fármaco se envuelve en una o dos moléculas de PEG (polietilenglicol) que protegen al fármaco del sistema metabólico humano, prolongando así la actividad del mismo.

Ej: modificación del interferón-alfa-2a recombinante (fabricado a partir de E.coli) como tratamiento de hepatitis B y C.

Beneficios: el fármaco permanece activo durante más tiempo en el cuerpo, se puede reducir la dosis administrada y fluctúan menos los niveles del fármaco (efectos secundarios más tolerables).

Biofármacos

Diferencias entre Biofármacos y Fármacos de Síntesis Química

Características Farmacocinéticas de los Biofármacos

Cuando la constante de eliminación es mayor a la de absorción.

Ventajas/Desventajas de Biofármacos

Ventajas: Eficacia y Seguridad

Gracias a su estructura, las proteínas tienen una afinidad fuerte por una molécula diana específica.

Son poco frecuentes la aparición de interferencias o interacciones peligrosas con otros fármacos, e incluso los efectos secundarios.

Desventajas:

Por su naturaleza, presentan una biodisponibilidad oral escasa.

Es más frecuente que desencadenen reacciones inmunes.

Tipos de Biofármacos

Los grupos principales de biofármacos se incluyen en los siguientes grupos:

• Anticuerpos monoclonales
• Citocinas
• Enzimas
• Proteínas hormonales
• Vacunas biotecnológicas

Anticuerpos Monoclonales

Son: anticuerpos que derivan todos de un mismo linfocito B.

Tipos: murinos, quiméricos y humanos.

Diferencias: en la región variable.

El inicio de la obtención de anticuerpos monoclonales frente a una proteína diana se realizó mediante la fusión de linfocitos B procedentes del bazo de ratones inmunizados con la proteína de interés, y una célula de mieloma (célula neoplásica de la misma estirpe que los linfocitos B).

La nueva célula se denominó HIBRIDOMA con propiedades:

• Capacidad de producir el anticuerpo
• Inmortalidad en cultivo

El uso clínico de los primeros anticuerpos monoclonales era mayoritariamente de origen murino (ratones).

Los anticuerpos de origen murino son capaces de desencadenar respuestas de anticuerpos humanos anti-Ig murinas: pérdida de eficacia y reacción inmunitaria generalizada.

Se han desarrollado nuevos tipos de anticuerpos monoclonales: anticuerpos recombinantes y fragmentos de anticuerpos (Fab).

En un anticuerpo quimérico las regiones variables provienen de una inmunoglobulina de origen murino, mientras que las regiones constantes tienen origen humano. Ej: infliximab.

En el desarrollo de anticuerpos humanizados (human-like): regiones hipervariables del anticuerpo murino entre las regiones de entramado de un dominio variable humano, generando un dominio variable híbrido, transfiriendo una especificidad de reconocimiento determinada a una molécula completamente humana en el resto de su secuencia.

En clínica también se utilizan:

FRAGMENTOS DE ANTICUERPO (Fab): moléculas completas de anticuerpo a las que se somete a determinados procesos químicos que eliminan selectivamente determinadas fracciones proteicas, dando lugar a moléculas más ligeras, menos inmunogénicas, más solubles, etc. Ej: bevacizumab.

PROTEÍNAS DE FUSIÓN: resultado de combinar partes de anticuerpos con fracciones peptídicas de determinados receptores biológicos o de sus correspondientes ligandos. Ej. abatacept.

La mayoría de los anticuerpos monoclonales están indicados en cuadros de artritis reumatoide o en neoplasias.

Citocinas

Las citocinas suelen ser moléculas peptídicas ligadas a cadenas glucídicas con el fin de incrementar su estabilidad y solubilidad en el medio extracelular.

Se trata de moléculas con elevada actividad biológica pero con una duración de efectos muy breve (degradación por proteasas).

Ejercen sus funciones reguladoras mediante la unión a receptores en la superficie de las células diana y, mediante señalización celular, activan una serie de factores de transcripción para que se transcriban unos genes concretos cuyos productos son los que ejercen el efecto biológico correspondiente.

Entre las citocinas:

FACTORES ESTIMULADORES DE LA FORMACIÓN DE COLONIAS (CSF) que afectan al crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas.

EPOETINA (eritropoyetina de origen recombinante): factor estimulante de la diferenciación y maduración de los precursores de eritrocitos.

IMPORTANTE: los receptores biológicos de la eritropoyetina pueden expresarse también sobre la superficie de diversas células tumorales y existe riesgo de trombosis: se ha cuestionado su utilización en pacientes con cáncer.

INTERLEUCINA: parte esencial del sistema inmunitario (intercomunicación entre subpoblaciones de leucocitos) y también efectos indirectos sobre crecimiento y diferenciación celular hematopoyética. Hasta el momento se comercializa una forma recombinante de interleucina 2.

INTERFERONES. Los de tipo I (alfa y beta) con efectos antivirales y antiproliferativos y el tipo II (gamma) con propiedades inmunomoduladoras.

Interaccionan con receptores de membrana pero el efecto ocurre en el núcleo mediante regulación de expresión de determinados genes y la represión de otros.

FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (TNF): hace referencia a la capacidad de esta citocina para provocar necrosis en algunos tumores pero participa también en la respuesta inmunitaria.

El único utilizado por el momento con fines terapéuticos es el TNF-alfa.

Enzimas

Enzimas empleadas en TERAPIAS DE RESTAURACIÓN: tratamiento de cuadros de deficiencia congénita o adquirida de determinadas enzimas implicadas en pasos metabólicos específicos.

ENZIMAS ANTITROMBÓTICAS. Enzimas recombinantes que tienen por misión estimular el sistema fibrinolítico endógeno.

En cuanto a la especificidad, los agentes antitrombóticos pueden ser clasificados principalmente en: agentes inespecíficos o fibrinolíticos (estimulan la fibrinolisis donde existe plasminógeno) y los específicos o trombolíticos (activan la fibrinolisis donde hay fibrina).

FACTORES DE LA COAGULACIÓN SANGUÍNEA. Las formas recombinantes no presentan ventajas adicionales frente a productos obtenidos mediante extracción salvo la disponibilidad y la reducción del riesgo de contaminación biológica.

Proteínas Hormonales

INSULINA. Todas las insulinas comercializadas tienen un origen biotecnológico.

Modificaciones en la estructura molecular de la insulina pueden adelantar el comienzo de la acción y emular el perfil cinético de la insulina fisiológica o producir un efecto mantenido a lo largo de más tiempo (liberación más lenta).

GONADOTROPINAS HIPOFISARIAS. Hormonas de naturaleza glucoproteica que actúan en la iniciación y regulación de la gametogénesis.

PROTEÍNA OSTEOGÉNICA 1: induce la formación de nuevo hueso fisiológicamente normal.

HORMONAS SECRETADAS POR EL LÓBULO ANTERIOR DE LA HIPÓFISIS:

La SOMATOTROPINA tiene un origen recombinante en todos los fármacos comercializados.

La HORMONA PARATIROIDEA ó PARATHORMONA (PTH) como estimuladora de la formación ósea.

Vacunas

Sólo una pequeña minoría de las vacunas comercializadas en España son recombinantes.

Para virus que el sistema inmune no es capaz de eliminar totalmente en ocasiones, cronificándose la infección y con potencial tumoral que se puede manifestar a largo plazo.

Crecen mal en cultivos de tejido.

VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB). La partícula infectiva tiene forma esférica y presenta una capa lipídica externa en la que se insertan múltiples copias de la proteína viral, que es el antígeno de superficie para proteger frente a la infección clínica del VHB.

VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO. Presenta una capa externa formada por dos proteínas: L1 y L2. La L1 es la proteína más importante para inducir la respuesta inmunitaria protectora.

FÁRMACOS BIOSIMILARES

Las copias de los fármacos biotecnológicos se conocen como BIOSIMILARES.

Son producidos por un fabricante diferente del original, utilizando nuevas líneas celulares, nuevos procesos y nuevos métodos analíticos.

Pueden existir diferencias en cuanto al producto final que ocasionen ciertas características específicas a nivel de la actividad del medicamento o la aparición de determinados efectos adversos por la inmunogenicidad que pueden desarrollar.

Ej: diferencias en la glucosilación de las epoetinas (eritropoyetinas) biosimilares pueden ocasionar diferencias de hasta un 20% en la actividad con respecto al original porque la glucosilación determina la actividad biológica de la proteína.

Otras aplicaciones de biotecnología: Pruebas genéticas

MICROSATÉLITES-PATERNIDAD

Los marcadores microsatélites también se conocen como STRs (Short Tandem Repeats).

Se emplean comúnmente en la identificación humana debido a que son muy polimórficos (gran poder de discriminación), tasa de mutación relativamente baja, tamaño pequeño y ubicación cromosómica establecida.

Varios de estos marcadores pueden amplificarse mediante PCR de forma simultánea (multiplex).

El CODIS (Combined DNA Index System), es la base de datos de DNA creada por el FBI (USA).

El CODIS utiliza un conjunto estándar de 13 regiones STRs específicos.

AMELOGENINA Discriminación del sexo

MICROSATÉLITES-PATERNIDAD Número de alelos para cada locus STR del CODIS

ACTIVIDAD MICROSATÉLITES-PATERNIDAD

Primer paso: Elaboración del árbol genealógico de una familia

Segundo paso: Recopilación datos análisis STR

Ejercicio: recopilar la información de los 3 marcadores para todos los individuos de la familia de Bob.

Ejercicio1 : Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina, ¿apoyan todos los datos sobre los genotipos de Bob, Ana, María, y David la posibilidad de que Bob y Ana son los padres biológicos de María y David?

Ejercicio 2: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Los alelos que Bob transmite a sus descendientes los heredó a su vez de Alfredo y Nuria. Identificar los alelos de los genotipos de María y David que se han heredado sin ambigüedad de cada uno de sus abuelos paternos.

Ejercicio 3: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Si no se conoce el perfil genético de Esteban pero se sabe con certeza que es el padre de Teresa, Mónica y Esther junto con su mujer Luisa, ¿qué predicciones podríamos hacer acerca de su composición para cada uno de estos marcadores?

Clonación de organismos:

«Desde el punto de vista genético un clon no es otra cosa que un gemelo que viene al mundo con retraso» (Jens Reich).

Primeros animales en ser clonados: ranas.

Primer mamífero clonado: DOLLY en el Instituto Rosalina (Escocia).

Procedimiento:

– Extracción de células de glándula mamaria de oveja

– Cultivo celular

– Núcleos celulares se inyectan en óvulo enucleado de otra raza de oveja

– Desarrollo embrionario que da lugar a oveja clonada (Dolly: 5 de julio de 1996)

Dolly: clonación a partir de una célula de glándula mamaría por transferencia de su núcleo a un óvulo enucleado.

CONCLUSIONES:

Una célula somática puede «olvidar» todas las especificidades (diferenciación) y actuar como si fuera un óvulo fecundado «totipotente».

Procedimiento poco eficiente: la mayoría de ovejas gestantes tuvieron abortos.

Se ha descubierto que algunos animales clonados poseen telómeros más cortos que sus congéneres de la misma edad.

DIFICULTADES:

– El núcleo celular procede de una célula corporal diferenciada, en la cual ciertos genes están bloqueados. Para poder reprogramar el DNA bloqueado se deben mantener los núcleos de las células somáticas en un medio de cultivo pobre en nutrientes.

– El núcleo celular del donante está dañado de antemano por la luz UV, radicales de oxígeno reactivo (ROS) y sustancias tóxicas.

– La interacción entre óvulos enucleados y núcleos celulares no funciona sin fallos. El plasma celular del óvulo controla la función del núcleo celular correspondiente.

– El clon no es una copia exacta del donante: el DNA mitocondrial procede de la donante de óvulos. Clon genómico.