Recuento de Células Sanguíneas

Los estudios cuantitativos de los elementos formes de la sangre se expresan en C’s/µl o en unidades del S.I.: C’s/l. Forman parte del hemograma y pueden ser manuales o automáticos.

Fases del Recuento de Células Sanguíneas

1. Dilución de la sangre
2. Toma de un volumen determinado de sangre diluida
3. Recuento de las células en ese volumen
4. Cálculo matemático para determinar el número de células por litro o µl

Material para el Recuento Celular Mediante Cámara

• Cámara de recuento
• Pipetas de dilución
• Microscopio
• Líquido de dilución

Cámara Cuenta Glóbulos. Hemocitómetro

Aparato de vidrio óptico especial empleado para contar células u otras partículas en suspensión mediante el microscopio. Tamaño algo mayor que un porta, en el centro tiene una plataforma en la que está grabado el retículo de recuento. El retículo puede ser simple o doble.

Tipos de Cámara de Recuento

Hay varios modelos en función de la retícula central:

• Neubauer
• Neubauer mejorada o Improved, la usada habitualmente
• Fusch Rosenthal
• Malassez

Cámara de Neubauer

El retículo tiene una superficie de 9mm² (3 mm de lado) y está dividido en 9 cuadrados secundarios de 1mm² de superficie. Los cuadrados secundarios de las esquinas se emplean para el recuento de leucocitos y plaquetas y están subdivididos en 16 cuadrados terciarios de 1/16 mm² cada uno. El cuadrado secundario del centro se usa para el recuento de hematíes y es diferente según sea una cámara de Neubauer o de Neubauer mejorada.

Retícula de Hematíes: Neubauer

Está dividida en 16 cuadrados terciarios de 1/16 mm² de superficie, cada cuadrado terciario contiene 25 cuadraditos pequeños de 1/400mm² de superficie.

Retícula de Hematíes: Neubauer Mejorada

Está dividida en 25 cuadrados terciarios de 1/25 mm² de superficie, cada cuadrado terciario contiene 16 cuadraditos pequeños de 1/400mm² de superficie. La cámara se acompaña de un cubreobjetos grueso y de caras planas.

Colocación del Cubreobjetos

Se coloca sobre las plataformas laterales, deja un espacio entre el retículo y el cubre de 0,1mm, en este espacio se coloca la sangre diluida para el recuento.

Limpieza de la Cámara

Inmediatamente después de su uso debe ser aclarada con agua tibia, secar con un paño suave y limpio o bien dejándola al aire. Si tiene células adheridas se puede meter durante 10-15 minutos en un baño de ultrasonidos inmersa en agua jabonosa o simplemente agua.

Pipetas de Dilución

Se usan para diluir la sangre y cargar la cámara una vez diluida. Hay dos tipos: uno para plaquetas y hematíes y otras para el recuento de leucocitos. Hay varios modelos, aunque las más usuales son las de Thoma. Son de vidrio y están constituidas por un capilar que se continúa con una dilatación ampular o bulbo y termina con un pequeño capilar que se conecta al sistema de aspiración. Dentro de la ampolla tienen una bolita roja o blanca según su uso. El volumen de la ampolla es múltiplo entero del volumen capilar de la misma: 100 en hematíes, 10 en leucocitos. Ambas tienen en la mitad una señal que marca la mitad del mismo (0,5) para conseguir diluciones el doble de las anteriores. Para facilitar el llenado y enrase va conectada a un tubo aspirador para pipeta cuenta glóbulos.

Limpieza de las Pipetas de Dilución

Después de su uso las pipetas deben lavarse pasándolas sucesivamente por agua jabonosa, lejía, agua destilada, alcohol y éter, agitando en cada paso las pipetas. La limpieza se facilita conectando las pipetas a una bomba de vacío y aspirando cada uno de los líquidos. Secar con una corriente de aire seco o en estufa a 56ºC. La ampolla está seca si la bolita se mueve libremente.

Líquido de Dilución

La dilución de la muestra se hace con líquidos diferentes según lo que se vaya a contar. Para contar hematíes se emplea el líquido de Hayem. En el recuento leucocitario se emplea el líquido de Turk. Para contar plaquetas se usa una solución antiagregante.

Líquido de Hayem

Se usa en el recuento de hematíes, es isotónico para no dañar al hematíe. Contiene mercurio que destruye a los leucocitos y facilita el recuento.

Composición:

• Cl₂Hg – 0,25g
• ClNa 0,50g
• SO₄Na₂ – 2,50g
• H₂O c.s.p. 100ml

Líquido de Turk

Se usa en el recuento de leucocitos, tiñe ligeramente el núcleo. Contiene un hemolítico que destruye a los hematíes y facilita el recuento.

Composición:

• Ácido acético glacial 2ml
• Violeta de genciana 1ml
• H₂O c.s.p. 100ml

Pasos Generales de un Recuento Manual

1. Dilución adecuada de la muestra
2. Llenado correcto de la cámara
3. Recuento fiable
4. Expresar los resultados en las unidades usadas en el laboratorio

Dilución Adecuada de la Muestra

• El diluyente será específico para cada tipo de célula.
• La muestra se diluirá lo suficiente como para que las células estén separadas unas de otras.

La dilución será exacta: La mezcla de sangre y diluyente debe ser homogénea.

Llenado Correcto de la Cámara

La cámara, una vez montada, se llena por capilaridad, acercando la punta de la pipeta al borde del cubre.

Recuento Fiable

• Comprobar la distribución homogénea de las células por toda la cámara.
• Contar las células siguiendo un orden.
• Evitar contar repetidamente las C’s que tocan las líneas, para ello solo se cuentan las que están en contacto con las líneas superior y derecha de cada cuadro.

Expresar los Resultados en Unidades Usadas en el Laboratorio

Cuando se hace un recuento celular con cámara de Neubauer o similar, el cálculo del número de células por µl puede realizarse aplicando la siguiente fórmula:

Nº C’s/mm³ = Nº C’s contadas x Dilución de la muestra / Nº cuadros contados x Volumen en µl del tipo de cuadro contado

Causas de Error en los Recuentos Manuales

• Relacionados con la muestra: Sangre capilar que no fluye libremente, sangre con coágulos, envejecimiento de la muestra.
• Relacionados con el material: Material en mal estado, mal calibrado de pipetas, reactivos caducados.
• Relacionados con la técnica: Dilución incorrecta, mal llenado de la cámara, mala distribución de las C’s, error de apreciación visual de las C’s situadas en las líneas o nº de cuadros contados.
• Relacionados con los cálculos: Errores al efectuar los cálculos.

Recuentos Automáticos

Elementos básicos de un contador hematológico:

• Diluidor
• Cámara de flujo
• Dispositivo de medida
• Transductor
• Sistema informático
• Lectora impresora

Contadores Hematológicos

Los contadores automáticos detectan el paso de la célula aprovechando la interferencia que esta produce al paso de la corriente eléctrica o de la luz. En el primer caso se trata del método de la resistencia eléctrica y en el segundo de los métodos ópticos.

Método de la Resistencia Eléctrica (Coulter)

El líquido diluyente es un conductor isotónico. Tiene una cámara de flujo con un pequeño orificio que solo permite el paso de una sola C’s cada vez. A los lados de la cámara hay dos electrodos que establecen una corriente eléctrica constante. El paso de una C’s produce un aumento de la resistencia eléctrica y un cambio de potencial que son recogidos por el transductor. El nº de señales eléctricas indica el nº de C’s y su amplitud es proporcional al tamaño y complejidad celular.

Método del Campo Oscuro

Se basa en hacer pasar las C’s por una cámara de flujo y atravesar una zona sobre la que incide una luz halógena. Cuando no pasan C’s el haz incide sobre un disco opaco. El paso de una C’s origina una dispersión que es recogida por el fotodetector. El recuento tiene en cuenta el nº de veces que incide la luz en el fotodetector y la intensidad de la dispersión lumínica.

Método del Rayo Láser

La cámara de flujo es atravesada por un láser que incide sobre un sensor. El paso de una C’s desvía el láser y no incide sobre el sensor y se cuenta. Se completa con sensores de dispersión que recogen la luz desviada.

Tipos de Contadores Según su Capacidad para Discriminar Poblaciones Leucocitarias

• Contadores de una población: Un canal cuenta hematíes y plaquetas y otro leucocitos.
• Contador de tres poblaciones: Diferencia entre linfocitos, mixed y neutrófilos.
• Contadores de cinco poblaciones: Hacen recuento diferencial de cinco poblaciones leucocitarias.

Contador de Cinco Poblaciones

Determinan cinco poblaciones leucocitarias y la hemoglobina. Disponen de cuatro canales, cada uno con su sistema óptico correspondiente:

• Canal de las peroxidasas
• Canal de los basófilos
• Canal de hematíes y plaquetas
• Canal de la hemoglobina

Canal de las Peroxidasas

Cuenta e identifica los diversos tipos de leucocitos, midiendo su tamaño celular y la actividad peroxidasa. Su sistema óptico cuenta con un prisma que divide el haz de luz dispersada en dos: uno detecta la intensidad de la tinción, otro detecta volumen celular. Clasifica a los leucocitos en: linfocitos, monocitos y basófilos, neutrófilos, eosinófilos, LUC: C’s grandes no teñidas.

Canal de los Basófilos

Diferencia entre monocitos y basófilos. Aprovecha la afinidad de los gránulos de los basófilos por el azul alcian.

Citómetro de Flujo

Es un contador basado en el método del rayo láser, que tiene además unos detectores con filtros incorporados que solo detectan luz fluorescente y que posee un mínimo de cuatro detectores de dispersión de luz.

Detectores de un Citómetro de Flujo

• Detector longitudinal (FSC): Situado frente a la fuente de luz, informa sobre el nº y tamaño de las C’s.
• Detector situado a 90º (SSC): Informa sobre la complejidad celular.
• Otros detectores: También laterales pero que dejan pasar solo la luz fluorescente.

Aplicaciones del Citómetro de Flujo

• Permite detectar cualquier molécula para la que se disponga de un Ac monoclonal específico marcado con un fluorocromo.
• Permite diferenciar subpoblaciones linfocitarias entre sí.

Presentación de Resultados

• Listados
• Polígonos de frecuencias
• Diagramas de dispersión

Polígono de Frecuencias

Son representaciones gráficas sobre un eje de coordenadas. En abscisas se colocan los valores de la variable en estudio, en ordenadas su frecuencia. Dos líneas verticales sobre el eje de abscisas señalan el intervalo de normalidad.

Diagramas de Dispersión

En ordenadas se representa el tamaño de la C’s en estudio, en abscisas cualquier otra variable. El resultado es una nube de puntos.

Causas de Error

• En la manipulación de la muestra: Dilución o hemoconcentración en el tubo de extracción, error de coincidencia, hemólisis, coagulación total o parcial de la muestra, presencia de agregados plaquetarios.
• En el manejo del aparato: Uso de diluyentes inadecuados, mala calibración del aparato, limpieza defectuosa de los canales y sistemas de medida, averías de los sistemas electrónicos del aparato.

Material para el Recuento Celular

• Pipeta de dilución de Thoma para hematíes o leucocitos
• Tubo aspirador con boquilla
• Cámara de recuento
• Cubreobjetos
• Papel de filtro
• Gasas
• Microscopio
• Líquido de Hayem para hematíes
• Líquido de Turk para leucocitos

Muestras para el Recuento Celular

• Sangre venosa anticoagulada con EDTA
• Sangre capilar

Llenado de la Pipeta y Cámara

• Llenar la pipeta de sangre hasta la marca de 0,5 para una dilución de 1:200 en el caso de los hematíes o de 1:20 si son leucocitos.
• Llenar la pipeta de sangre hasta la marca de 1 para una dilución de 1:100 en el caso de los hematíes o de 1:10 si son leucocitos.
• Completar hasta la marca de 101, de la pipeta de hematíes, con líquido de Hayem.
• Completar hasta la marca de 11, de la pipeta de leucocitos, con líquido de Turk.

Recuento de Hematíes y Leucocitos

Cálculos del Recuento

• Hematíes:
  • A x 10.000 = Nº hematíes/mm³
  • A x 10¹⁰ = Nº hematíes/l
  • A = Nº de hematíes contados en 80 cuadraditos
• Leucocitos:
  • B x 50 = Nº leucocitos/mm³
  • B x 5 x 10⁷ = Nº leucocitos/l
  • B = Nº de leucocitos contados en 4 cuadrados secundarios

Siempre que la cámara sea una Neubauer mejorada, las diluciones de 1:200 o 1:20 respectivamente y el número de cuadrados contados sea el indicado en la técnica.