Genética del cáncer: Se considera como una enfermedad genetica, pero no siempre es hereditaria (depende de si afecta a cel somatica o germinal) y depende de factores ambientales. Tumor: Crecimiento incontrolado de células dentro de un tejido (forma masa irregular), se vuelve maligno cuando afecta a la funcionalidad  (deficit suministro nutrientes, los roban las celulas en continua division) y puede o no expandirse a otros tejidos (metastasis). Causa: Alteraciones en el ADN. Se produce crecimiento celular incontrolado. Diagnostico: Biopsia. Caracteristicas: celulas pierden forma y limites normales (poco definidos), forman masa celular anormal. Si atraviesan lamina basal y entran al torrente para situarse en nuevos tejidos se dice que han entrado en metastasis.

Modelo del cáncer en etapas de knudson, evolucion tumor: Define el cancer como resultado de la acumulacion de mutaciones. Si son heredables seran necesarias menos mutaciones para provocarlo. La mayoría de los tumores provienen de la acumulacion de mutaciones somaticas (espontaneas o inducidas) a lo largo de la vida, sera mas comun en edades avanzadas. Proceso: 1. La celula normal sufre su primera mutacion y se divide mas rapido que las demas (transmite mutacion a la descendencia). 2. Esto aumenta las probabilidades de sufrir una segunda mutacion en una de esas celulas progenie, se pierden controles normales replicacion, aumenta tasa replicacion. 3. Aumenta mas la probabilidad de acumular mas mutaciones en sucesivas divisiones, al final se convierte en celula cancerigena (pierde forma y limites normales, mas agresivas o proliferativas). 4. Esta celula maligna se replica y forma masa celular anormal o irregular que desplaza celulas sanas (se dividen mas lento) y generan el tumor. Evolución clonal: El cancer comienza en una celula normal que sufre primera mutacion y se divide mas rapido que las demas, su descendencia porta la mutacion. El aumento de replicacion aumenta probabilidades de mas mutaciones en otra cel que a su vez la transmite a la descendencia. Se van acumulando mutaciones hasta formar cel maligna que prolifera y desplaza a las celulas sanas. La tasa de evolución clonal depende de la frecuencia con la cual aparecen nuevas mutaciones.

Oncogenes y genes supresores de tumores: Provienen de prooncogenes, que activan la division celular normal mediante la sintesis de factor estimulacion. Una mutacion en un alelo del gen tiende a ser dominante, se expresara en individuos heterocigotos para ese gen. Produciran factor estimulador celular hiperactivo que es el que actua sobre la celula acelerando tasa division, pasaran a denominarse oncogenes. Los virus pueden activar los prooncogenes: Lo incorporan a su genoma viral por recombinacion, ahi puede mutar a oncogen (mas probable que de normal) y vuelve a ser insertado en la celula.

B. Genes supresores de tumores: Limita la division celular normal mediante la sintesis de factor inhibicion. Una mutacion en un alelo del gen tiende a ser recesiva, no se expresara en individuos heterocigotos (seguiran expresando factor inhibicion, pero menos), seran necesarias mutaciones en ambos alelos. Dejaran de producir factor inhibicion que actua sobre la celula acelerando tasa division. Perdida heterocigosidad: Los individuos que tengan un alelo ya mutado (el otro es dominante y expresa el factor de inhibicion) tienen mayor probabilidad de desarrollar mutacion otro alelo o que se pierda mediante delecion. Si se genera cancer solo con un alelo recesivo mutado se denomina Haploinsuficiencia. Ejemplo: Gen supresor de tumores p53 mutado en 75% de los tumores de colon, regula inhibidor potente actividad CDK. Genes que regulan apoptosis: Mutaciones pueden afectar a gen regulan apoptosis (se activa cuando hay daño en DNA por mutacion), la celula no muere y prolifera con la mutacion generando tumor.

Vías de transducción de señales: Intervienen en el ciclo celular. Permiten que a partir de una señal externa se active cascada reacciones intracelulares que producen una respuesta como la transcripcion que estimula expresion genes. Las señales externas son hormonas y factores de crecimiento, normalmente no pueden atravesar la memb (tamaño o carga) y se unen a receptores en superficie. Alteraciones en vias transduccion pueden generar cancer ya que afectan al ciclo celular. 0. La vía de Ras participa en el control del ciclo celular. Se activa por factor crecimiento epidermico (EFG) que actua como señal externa uniendose al receptor superficie celular. La fraccion interna del receptor cambia de conformacion y se une a la RAS (unida a GDP) activandola (transforma GDP en GTP). La RAS activa transforma RAF inactiva en activa y esta MEC inactiva en activa. La MEC activa la MAP kinasa que viaja al nucleo y estimula factores transcripcion que estimulan expresion genes crontrolan ciclo celular como oncogenes. Mutaciones en proteinas de la via RAS pueden provocar estimulacion continua de la via y con ello de la division celular por produccion cte factores transcripcion oncogenes.

Otros factores que contribuyen a la formación de tumores: Procesos controlan velocidad aparición mutaciones: Frecuencia aparicion errores y la eficacia de correccion. 1. Genes de reparación de DNA: Defectos en estos genes que codifican componentes sist reparacion se asocian a tumores, tambien reordenamientos cromosomas por cortes no reparados. Ejemplo: Xerodermia pigmentosa: Alteración sistema reparación escisión nucleótidos causado por mutágenos. 2. Genes que regulan a la telomerasa: La telomerasa se encarga de la replicacion de los telomeros (extremos cromosoma) en celulas germinales (no somaticas, lo que limita numero divisiones por destruccion cromosomas) ya que se acortan debido al posicionamiento del cebador, la ADN polimerasa no puede replicar extremos. Si muta el gen regulador de la telomerasa, puede replicar extremos cel somaticas que podran dividirse un num ilimitado de veces. 3. Genes que promueven la vascularización (angiogenesis): Las celulas mutadas con mayor tasa de replicacion necesitan mas aporte de O2 y nutrientes (mayor vascularizacion), la masa de celulas cancerigenas desplazan a las cel sanas y afectan a su funcionalidad robando aporte. En cel tumorales los genes que producen factores crecimiento vasos estan sobreexpresados o los inhibidores poco expresados. 4. Genes que promueven diseminación tumores (metastasis): Codifican componentes matriz extracelular y citoesqueleto. Si mutan se altera la estructura celular y facilita diseminacion. Ejemplo: la mutación del gen palladin contribuye metástasis tumores pancreáticos. 5. MicroRNA: Tipo de ARN que participa en el silenciamiento de genes que no deben expresarse, degrada ARNm o inhibe traduccion. Si disminuye el miARN aumenta expresion genes que deberian estar silenciados y podrian generar tumores. 6. Cambios estructura cromosomas: corresponden a reodenamientos cromosomicos durante la replicacion, pueden afectar a genes supresores de tumores o activar oncogenes. Translocaciones: Entre cromosoma 9 y 22 se asocia a leucemia mieloide cronica. Deleciones: Fragmento de cromosoma se pierde. Inversiones: Fragmento de cromosoma gira 180º dentro del mismo, genera gametos inviables. Duplicaciones: Un fragmento se duplica dentro del cromosoma. 7. Cambios en número de cromosomas: Se producen durante la replicacion y posterior division celular (mitosis o meiosis), el material genetico no se reparte por igual entre cel hijas. Aneuploidias y poliploidias. Se ganan o pierden genes, cuya expresion puede provocar el aumento de tasa replicacion celular y la aparicion de cancer. 8. Virus: Ciertos virus pueden activar los prooncogenes, lo incorporan a su genoma viral por recombinacion, ahi puede puta a oncogen (mas probable que de normal) y vuelve a ser insertado en la celula. Produciran factor estimulador celular hiperactivo que acelera tasa division aumentando probabilidad mutaciones. 9. Cambios metilación DNA: Proceso reversible. Hipermetilacion silencia genes supresores de tumores (mutacion un alelo), hipometilacion causa inestabilidad cromosoma. 10. Factores ambientales: Mutaciones inducidas por agentes externos. Explican diferencias en la incidencia tumores en diferentes lugares. Tabaquismo, qumicos, radiaciones.

Biotecnología:

Biotecnología = utilización de los procesos biológicos, especialmente la genética molecular y la tecnología del DNA recombinante, para generar productos de valor comercial.

Las técnicas de la genética molecular y de la tecnología del DNA recombinante se utilizan para localizar, aislar, analizar, alterar y recombinar secuencias de DNA.

Estas técnicas se usan para determinar la estructura y la función de los genes, para abordar problemas de varias áreas de la biología, para desarrollar productos comerciales, y para diagnosticar y tratar enfermedades.

Tecnología del ADN recombinante:

Juntar fragmentos de ADN de orígenes diferentes.

La tecnología del DNA recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural.

Procedimientos básicos:

Se generan fragmentos de DNA empleando unas enzimas denominadas endonucleasas de restricción.

Los fragmentos de DNA se unen a otras moléculas de DNA que sirven de vectores.

La molécula de DNA recombinante (vector+fragmenteo de ADN formado anteriormente) se transfiere a una célula huésped.

La replicación de la célula huésped origina clones de células que portan la secuencia de DNA.

Los fragmentos de DNA clonados se pueden purificar, analizar e incluso se puede obtener su producto génico y examinarlo.

Cortamos, introducimos en un vector, que entra en una célula, la célula se replica y obtenemos lo que queremos.

Enzimas:

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Enzima que corta fragmentos de ADN cuando encuentra su diana.

La piedra angular de la tecnología del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas endonucleasas de restricción.

Son enzimas aisladas de bacterias que reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucleico invasor.

Las endonucleasas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos (sitio de restricción) de una molécula de DNA de doble cadena y cortan el DNA.

Se han aislado tres tipos de enzimas de restricción de las bacterias. Las enzimas de tipo I y III cortan el DNA en sitios que están fuera de sus secuencias de reconocimiento. Las de tipo II reconocen secuencias específicas y cortan el DNA dentro de ellas, dentro del sitio de restricción.

Las enzimas se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico.

Las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción suelen tener de 4 a 8 pb de longitud.

La mayor parte de las secuencias de reconocimiento son palíndromos, es decir, secuencias que se leen igual hacia delante o hacia atrás.

Con unas flechas vemos los sitios de restricción donde se corta, normalmente va a oscilar entre pocas bases, 4-8pb.

Algunas enzimas cortan el esqueleto azúcar-fosfato de cada cadena de manera escalonada, dentro del sitio de reconocimiento, dejando extremos cortos monocatenarios quesobresalen (extremos cohesivos).

Estos extremos son complementarios entre sí y pueden aparearse de manera espontánea (puentes de hidrógeno).

Cuando los extremos cohesivos se han apareado, dos fragmentos de DNA pueden unirse por la enzima DNA ligasa.

Otras enzimas de restricción cortan el DNA formando extremos romos. No se cran fragmentos nucleotídicos de cadena única. No hay una unión de manera natural porque no se pueden unir por puentes de H.

Tendremos que usar la enzima adicional enzima desoxinucleotidil transferasa terminal que añade unas cadenas sencillas de nucleótidos a los extremos romos para formar colas complementarias de cadena sencilla.

La enzima DNA ligasa sella las uniones mediante uniones covalentes.

TÉCNICAS BÁSICAS DE MANIPULACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE DNA Y RNA

1.- PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

FUENTES DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Células epiteliales de la mucosa bucal, semen, folículo piloso, músculo.

Se usan tarjetas FTA, depositamos una gota de sangre en la tarjeta.

PROCEDIMIENTO GENERAL PARA PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1) Fragmentación de tejido, si esta obtenido a partir de un tejido, sino, no.

2) Lisis de las células (mecánica, química (usando reactivos, la más normal) y enzimática)

3) Separación de ácidos nucleicos de restos celulares (centrifugación, filtración, enzimas)

4) Purificación de ácidos nucleicos con respecto a otros ácidos nucleicos, proteínas solubles, lípidos, carbohidratos , sales y otros compuestos orgánicos, (cromatografía, precipitación, productos químicos)

EXTRACCIÓN DNA DE PLÁSMIDOS: método de lisis alcalina

1) Centrifugación del cultivo en medio selectivo

2) Resuspender en solución amortiguadora de PH y EDTA (quelante de iones Mg2+, inhibe nucleasas)

3) Lisis y desnaturalización ALCALINA (SDS que disuelve lípidos de membrana y desnaturaliza proteínas y NaOH desnaturaliza proteínas y DNA separando DNA cromosómico y plasmídico)

4) Neutralización en acetato de amonio precipitación de proteínas y DNA cromosómico que se pueden separar por centrifugación del DNA plasmídico)

2.- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Desarrollada en 1983 por Mullis.

Permite amplificar fragmentos de DNA in vitro apartir de muy pequeñas cantidades de DNA original.

Se trata de una replicación catalizada por una DNA polimerasa (Taq polimerasa, se llama así porque la obtenemos de una bacteria) y tiene dos requisitos fundamentales: un molde de DNA monocatenario a partir del cual puede copiarse una nueva cadena de DNA y un cebador con un grupo 3′-OH al que pueden agregarse los nuevos nucleótidos. De la misma manera la ADN polimerasa necesita cebadores en la forma natural.

La reacción consta de 3 fases de pocos minutos que se repiten n veces:

1) Desnaturalización (90-100°C): se rompen los puentes de hidrógeno entre las 2 cadenas.

2) Hibridación con elcebador (annealing) a temperatura variable de 30-65°C, depende de secuencia del cebador. La elección del cebador será esencial.

3) Extensión o elongación (72°C aproximadamente): la DNA polimerasa sintetiza las nuevas cadenas de DNA.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Tras n ciclos: 2ncopias del fragmento amplificado.

La DNA polimerasa, estable a las temperaturas elevadas del primer paso de la PCR, se obtiene por aislamiento a partir de bacteria Thermus aquaticus: Taq polimerasa.

El problema de una PCR normal es que al subir la temperatura por encima de 90º se desnaturalizaba, así que se uso esta bacteria que vivía en medios extremos y que contenía la polimerasa que se emplea.

Uso de termocicladores automáticos.

VENTAJAS GENERALES DE LA PCR

Rápido y «fácil» de practicar.

Muy sensible (se puede partir de cantidades muy pequeñas de DNA blanco). Aplicación en diagnóstico, análisis de parentesco, ciencia forense. Por la capacidad de replicar la cantidad de ADN.

Posibilidad de amplificar DNA a partir de multitud de muestras, incluidos tejidos en descomposición. Aplicación en investigación arqueológica, patología molecular.

La lejía destruye el ADN.

LIMITACIONES DE LA PCR

Conocimiento previo de secuencia del DNA diana. No vamos a poder analizar todo el genoma de una persona, solo un gen concreto con los primers, para ello necesitamos saber primero que secuencia de genes queremos ver y así elegir el primer.

Contaminación. Sobre todo por parte del investigador.

Exactitud de la Taq polimerasa: no capacidad de corrección. Como cualquier enzima a la hora de amplificación va a producir errores, así que hay que tener controles positivos, negativos… limitando el tamaño de los fragmentos limitamos también la cantidad de errores.

Tamaño de los fragmentos: elección de sistema de clonación basado en células. Por debajo de los 1500-2000 pares de bases. Si queremos pares de bases más pequeño usaremos el proceso de clonación basado en células.

ALGUNOS TIPOS FRECUENTES DE PCR

1) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): empleo de cebadores inespecíficos pequeños y con baja temperatura de hibridación en la PCR.

Cuanto más baja sea la Tº de hibridación, más inespecífica va a ser la fase.

Para que sea más inespecífico, le bajamos el tamaño del cebador, se unirá a muchos sitios porque las bases son más pequeñas, por lo tanto se amplificaran muchos fragmentos.

Amplia representación del genoma del individuo analizado.

Permite detectar mutaciones incluso de un único nucleótido (SNPs: SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMs) si se altera la secuencia complementaria del primer. Una de las aplicaciones es el análisis de mutagenicidad. Si un fragmento esta mutado en un individuo, al compararlo con el de alguien que es sano. Las mutaciones si están localizadas en el sitio de unión del cebador, desaparecerán estos fragmentos, pues cambia el patrón genético, también puede que tenga un fragmento extra debido a la mutación producida. Como es muy inespecífico habrá muchos patrones de bandas.

El producto de PCR de una reacción tipo RAPD suele incluir múltiples fragmentos de amplificación.

Ventajas:

No se necesita conocimiento previo de secuencias de DNA para diseño de primers.

Dificultades:

Se necesita optimizar la reacción de PCR para evitar problemas de reproducibilidad. Porque usamos temperaturas bajas y condiciones poco especificas para realizar la PCR, variaciones en la Tº hace que los resultados de un día sean diferentes a los del día siguiente.

2) PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism): amplificación por PCR y posterior digestión de producto de PCR con endonucleasas de restricción.

Permite distinguir entre alelos que difieren tan sólo en un único nucleótido (SNPs) si esta variación afecta a un nucleótido del sitio de restricciónde una endonucleasa de restricción.

3) ARMS (Amplyfication Refractory Mutation System) se basa en la dependencia esencial en el apareamiento de bases correcto en el extremo 3′ de primers unidos a la cadena de DNA.

El último, debe de hibridar realmente bien para que tenga lugar la PCR.

En este caso hacemos coincidir el SNPs en la posicion 3’ de 2 primers diferentes, diseñamos 2 primers, uno que hibride con un alelo y otro que hibride con otro alelo.

Haremos que un primer hibride con adenina y que otro hibride con guanina, por lo tanto haremos 2 PCR.

En una tendremos el A mas el R y en otro el C y el R, asi que en cada PCR amplifico cada uno de esos genes.

Para un homocigoto 1-1 solo habra amplicigacion A+R, no habrá en B+R. Uno 2-2 no tendrá A+R y si B+R. Un heterocigoto (1-2) tendra ambos, A+R y B+R.

Hace posible distinguir entre alelos que difieren tan sólo en un único nucleótido (SNPs).

Los cebadores se preparan con sus nucleótidos en el extremo 3′ diseñados para formar pares de bases con el nucleótido variable que distingue los dos alelos.

Requiere condiciones experimentales adecuadas para distinguir ambos alelos.

4) PCR anidada o con cebador anidado: para incrementar la especificidad. Se diluyen los productos de una reacción de amplificación inicial y se emplean como fuente de DNA de inicio para una segunda reacción en la que se usa un grupo de cebadores diferentes que corresponden a secuencias localizadas próximas pero internas en la primera reacción.

Vamos a hacer 2 PCR consecutivas, el producto de la primera nos sirve de muestra a partir de la cual haremos la segunda.

El diseño de los primers: tendremos primers que amplifican un fragmento de ADN. Este producto se hace pasar por una segunda, nos amplifican, dentro de ese fragmento de la primera, un fragmento más pequeño.

De esta forma aumentamos la especificidad de la PCR, no ponemos esta segunda pareja en contacto con todo el genoma, si no que solo amplificara dentro del fragmento más grande.

Cuando tenemos muestras con muy poca cantidad de ADN inicial y con una PCR es difícil su visualización, en estos casos usamos este tipo de PCR.

5) PCR-TI (PCR de transcriptasa inversa): PCR que parte de mRNA y la transcriptasa inversa produce cDNA (DNA complementario).

Nos indica que en lugar de partir de RNA partimos de mRNA, que por retrotranscripción hacemos DNA complementario al que le aplicamos una PCR normal. Ese ADN esta en proceso de expresión. Si queremos saber si en las personas están expresando el ADN, tendremos que partir del mARN. Principalmente se utiliza para el análisis de expresión génica

6) PCR en tiempo real.PCR cuantitativa en la que se mide de forma continua la cantidad de secuencias amplificadas. Los equipos de amplificación llevan incorporados un sistema de detección de fluorescencia.

Vamos obteniendo de forma continua información del proceso.

Necesitaremos equipos que detecten la fluorescencia de aquello que van replicando ciclo a ciclo.

Ventajas de la PCR en Tiempo Real:

Mayor sensibilidad. Puede detectar menores cantidades de ADN al principio.

Resultados reproducibles y mucho más precisos

Lo de abajo es el número de ciclos (de 0 a 40). La fluorescencia va detectando a tiempo real. A principio da una fluorescencia baja, luego no varia, cuando aumentan los ciclos se empiezan a visualizar los productos, y se ve la subida exponencial de la fluorescencia.

Hay un ciclo, el Ct, que va a ser el resultado de la PCR a tiempo real. Es el ciclo en el que aumenta exponencialmente la fluorescencia, después seguirá aumentando. En una PCR normal solo veríamos la parte del final.

Lo importante es el ciclo a partir de donde se empieza a aumentar la fluorescencia, en todas las muestras nos dará el mismo resultado, el mismo ciclo a partir del cual aumenta exponencialmente la fluorescencia de la muestra. Ct.

Diferentes puntos finales en replicados como resultado de PCR convencional

Alta precisión durante la fase exponencial (resultado de RT-PCR)

El parámetro fundamental, a partir del cual se realizan los cálculos analíticos y la obtención de resultados en la RT-PCR es el CICLO UMBRAL (Threshold Cycle ó Ct) que es el ciclo a partir del cual la fluorescencia es estadísticamente significativa por encima del ruido de fondo (background).

En una muestra con poca cantidad de DNA, el Ct será mayor que si hay mucho ADN inicial. Normal, si hay mucho ADN se replica antes, cuanto menos hay más tarda. Por tanto nos indica cuanta cantidad de ADN inicial hay.

Propiedades del Ciclo Umbral:

Separa los datos del ruido de fondo (background)(suele establecerse como 10 veces el ruido de fondo)

Determina el ciclo inicial de amplificación.

Es inversamente proporcional al número de copias inicial del DNA de la muestra. Cuanto más DNA el Ct es más pequeño y viceversa.

Se emplean diferentes tipos de fluoróforos. (sustancias que hacen que aparezca la fluorescencia)

a) NO ESPECÍFICOS. Detectan todos los DNA de doble cadena producidos durante la reacción de amplificación (producto específico, producto inespecífico e incluso dímeros de primers). Se unirán a cualquier fragmento de ADN de doble cadena.

Consiste en añadir un agente intercalante de la doble cadena que es un fluoróforo que emite fluorescencia cuando se une a moléculas de DNA de doble cadena y se excita a una longitud de onda específica para cada fluoróforo. Ej: SYBR Green.

Lo que emite fluorescencia, al no ser especifico, puede ser lo que buscamos o no. Solo se usan en casos muy contados en los que hay muchísima especificidad de la PCR.

b) ESPECÍFICOS. Se basan en la utilización de quenchers y sondas marcadas con un amplio rango de fluoróforos. Además usaremos los Quencher que nos van a permitir marcar las sondas con los fluoróforos.

Los fluoróforos son moléculas que absorben energía y pasan a un estado excitado; posteriormente, al volver al estado inicial emite el exceso de energía en forma de fluorescencia.

Los quenchers son moléculas que aceptan la energía de un fluoróforo y la disipan en forma de calor o fluorescencia. Cuando un Quencher y un fluoróforo se encuentran juntos o muy próximos no se emite fluorescencia. Cuando se separan si emite la fluorescencia. Esa separación física entre fluoróforo y Quencher es lo que utilizaremos.

3 sondas específicas más utilizadas:

Sondas TaqMan. La más usada. En estas sondas se une un fluoróforo (repórter) al extremo 5′ de la sonda y un quencher al 3′. Dentro de la misma sonda tendrá reporter y Quencher. Como el Quencher, capta la energía, no hay fluorescencia. Para que haya fluorescencia algo ha de cortar esta cadena, y va a ser la polimerasa.

Cuando la Taq polimerasa empieza a amplificar a partir del primer unido al DNA diana, desplaza el extremo 5′ de la sonda que es degradado por la actividad exonucleasa 5′  3′ de la Taq, se libera el fluoróforo al medio separándolo del quencher, lo que ocasiona un aumento de la fluorescencia detectada.

Después de que se unan las sondas, también se unen los primers, cuando empiezan a amplificar la cadena, la Taq polimerasa quita el floroforo por la actividad exonucleasa y se produce la fluorescencia.

Sondas Molecular Beacon. Consisten en una estructura en horquilla en la cual el bucle es DNA monocatenario complementario del amplicón. El brazo de la horquilla tiene una longitud aproximada de 6 bases, está formada por C y G y es la encargada de mantener la estructura de la horquilla. El fluoróforo está unido a uno de los extremos del brazo y el quencher al otro extremo.

Tenemos una estructura secundaria, la parte del bucle es lo que tiene que hibridar con el ADN. Los 2 extremos de la horquilla van a ser comunes para todos los beacon, van a ser bases complementarias de C-G. Así hacemos que se aproximen el reporter y el Quecher, y así este no produce fluorescencia.

Durante la PCR, la sonda se une a la secuencia específica del DNA diana ya que el heterodúplex sonda-diana es termodinámicamente más estable que la estructura de horquilla de la sonda.

En la parte de hibridación solo hibrida lo del bucle y se quedan los brazos de C y G colgando. Como el reporter y Quencher ya no están tan juntos emite fluorescencia. Nos permite hacer sondas más grandes.

Sondas Scorpion. Tienen una estructura de horquilla al igual que las sondas Molecular Beacon, pero la horquilla está unida al extremo 5′ de un primer específico por medio de un «bloqueante de la PCR».

La unión de la sonda a la secuencia diana es intramolecular. Durante la PCR, después de la extensión del primer, la secuencia específica de la sonda se une a la región complementaria dentro de la misma hebra de DNA. La hibridación abre la estructura de horquilla y se observa un incremento de la fluorescencia.

Principales aplicaciones:

Cuantificación (n° de moléculas iniciales de DNA, cuantificación de expresión gènica…)

Discriminación alélica (empleo de sondas marcadas con fluoróforos diferentes para cada alelo que se necesite identificar)

3. HIBRIDACIÓN Y MARCAJE DE SONDAS

HIBRIDACIÓN

El DNA tiene capacidad de, una vez desnaturalizado, volver a unirse o formar pares de bases entre cadenas complementarias.

Esta capacidad permite la formación de moléculas híbridas cuando se mezclan moléculas de DNA homólogas desnaturalizadas provenientes de dos fuentes diferentes y se mantienen condiciones apropiadas de fuerza iónica y temperatura.

El proceso de apareamiento de bases entre monocadenas de polinucleótidos complementarios provenientes de fuentes distintas se denomina HIBRIDACIÓN.

Muchas técnicas dependen de la especificidad de la hibridación entre dos moléculas de DNA con secuencias complementarias.

Ejemplos: primeros y sondas en técnica PCR y sondas para detección de secuencias en técnicas de clonación de DNA basada en células.

Este método permite identificar las secuencias específicas dentro de compuestos complejos de ácidos nucleicos.

DISEÑO DE PRIMERS

PRIMER (o cebador): punto de anclaje de la DNA polimerasa y promotor del inicio de la reacción de replicación del DNA en puntos deseados de una muestra.

Propiedades de un primer:

1) Debe ser específico de la región que se quiere replicar.

2) Debe unirse con suficiente energía para soportar las condiciones del experimento.

3) No debe permitir la formación de estructuras que dificulten la reacción.

La obtención de un producto final como resultado de la reacción en cadena de la polimerasa depende en buena medida del diseño de los primers.

Específicos para secuencias que flanquean a la secuencia blanco (orientación opuesta).

Tamaño. Influye en especificidad, ta de fusión y tiempo necesario para la hibridación. Inversamente proporcional a eficacia hibridación.

Composición de bases: contenido de GC de 40 a 60% con una distribución uniforme de los cuatro nucleótidos.

Temperatura de fusión (Tm) de los 2 cebadores no debe variar más de 5°C. Estima la estabilidad de la unión del primer al DNA.

Tm = 2°C (A + T) + 4°C (G + C)

Secuencias terminales 3′ no deben ser complementarias a ninguna región del otro cebador en la misma reacción.

Se aconseja que el extremo terminal 3′ acabe en C ó G.

Evitar secuencias invertidas o autocomplementarias > de 3 pb.

GENBANK (LOCALIZAR GEN): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

PRIMER3 (DISEÑO DE PRIMERS): http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

BLAST (CHEQUEO DE PRIMERS CON SECUENCIAS GENBANK)

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Nucleot ides&PROGRAM=blastn&BLAST PROGRAMS=mega Blast&PAGE TYPE=BlastSearch&SHOW DEFAULTS

=on

MARCAJE DE SONDAS

La sonda con una secuencia conocida de nucleótidos puede ser un fragmento purificado o una molécula de DNA sintetizada por métodos químicos.

La sonda debe estar marcada para localizarla de inmediato una vez que encuentre la secuencia buscada.

Hay dos métodos principales que permiten marcar el DNA:

Agregar una señal al extremo de una molécula de DNA completa (normalmente en el grupo fosfato en 5′).

Marcar por incorporación mediante PCR de un precursor marcado (nucleótidos modificados con moléculas fluorescentes o átomos radiactivos).

4. ELECTROFORESIS EN GELES

ELECTROFORESIS EN GELES

La electroforesis es una técnica bioquímica estándar para la separación de moléculas según su tamaño y su carga eléctrica.

Las moléculas lineales de DNA se separan cuando se someten a un campo eléctrico a través de una matriz tipo gel, que es un material poroso inerte.

Las moléculas de DNA tienen carga negativa y cuando se someten a un campo eléctrico migran a través del gel hacia el polo positivo.

Se utilizan dos tipos alternativos de matrices de gel: la poliacrilamida (mayor capacidad de resolución pero sólo sirve para la separación de fragmentos de pocos cientos de bases) y la agarosa (más común).

GELES DE AGAROSA

La agarosa es un polisacárido que se funde en una solución buffer y se deja solidificar en un molde.

Las moléculas de DNA son flexibles y ocupan un volumen efectivo.

Cuando se somete a una corriente eléctrica, los poros en la matriz tipo gel tamizan las moléculas de DNA de acuerdo con este volumen.

Las moléculas grandes migran a través del gel con mayor lentitud porque tienen un volumen efectivo mayor que las pequeñas y tienen mayor dificultad para atravesar los intesticios del gel.

La visualización del resultado de la electroforesis en gel de agarosa requiere que el gel haya sido teñido previamente.

Las tinciones más frecuentes son:

a) bromuro de etidio: agente intercalante del DNA que produce bandas de color anaranjado brillante (fluorescencia) cuando se expone el gel a luz UV.

b) SYBR Safe: agente intercalante del DNA, mayor seguridad de uso que bromuro de etidio.

A veces se tiñen directamente los fragmentos de DNA mediante adición de marcación radiactiva o sustancia química antes de colocarlo en el gel.

ELECTROFORESIS EN GELES

La electroforesis también se usa para la separación de moléculas de RNA y proteínas.

1) El RNA tiene una carga negativa uniforme pero las moléculas de RNA suelen ser monocatenarias y poseen estructuras secundaria y terciaria extensas que influyen en su movilidad electroforética.

Las moléculas de RNA se pueden tratar con reactivos, como el glioxal, que reacciona con el RNA para impedir la formación de los pares de bases y así migrarán con una movilidad aproximadamente proporcional a su peso molecular.

2) Las proteínas no tienen carga negativa ni estructura secundaria uniformes. En función de los aminoácidos van a tener una carga u otra. Van a poder formar estructuras secundarias.

Si la proteína se expone a un detergente iónico fuerte como el dodecil sulfato de sodio (SDS). Los iones de SDS cubren la cadena polipeptídica y le otorgan una carga negativa uniforme. Así solucionamos el 1º problema.

El mercaptoetanol (agente reductor) reduce las uniones disulfuro entre los residuos de cisteína: suelen desaparecer las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias (complejos multiméricos).

Las proteínas se pueden observar con un colorante como el azul brillante de Coomassie.

En ausencia de SDS, se puede emplear la electroforesis para separar proteínas en función de otras propiedades como el punto isoeléctrico (pH en el que una proteína no exhibe carga neta).

5. TRANSFERENCIA A MEMBRANAS

HIBRIDACIÓN SOUTHERN BLOT (si transferimos ADN)

Sirve para localizar fragmentos de ácidos nucleicos específicos después de separarlos mediante electroforesis. Requerirá un primer paso que es la electroforesis del DNA que estamos usando digerido previamente con endonucleasas de transcripción.

El DNA blanco se digiere con una o más endonucleasas de restricción, lo que genera fragmentos que tienen de varios cientos a varios miles de pares de bases de longitud.

Los fragmentos de restricción se fraccionan según su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa, se desnaturalizan (solución alcalina) y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o nylon para hibridación (carga positiva).

Tras haber desnaturalizado el ADN. La característica que tiene que tener es que este cargada positivamente.

Los fragmentos de DNA se fijan en la membrana en posiciones comparables con los sitios donde migraron a través del gel durante la electroforesis.

Se incuba el DNA unido a la membrana con una sonda de DNA que tiene una secuencia complementaria a la del gen buscado, en condiciones de hibridación específica (concentración salina y temperatura).

Se lava la membrana para eliminar la sonda que no se ha unido.

Para detectar el sitio sobre la región de transferencia donde la sonda realiza la hibridación se puede emplear diferentes procedimientos: radiactivos o químicos.

Aplicación: identificación del tamaño de un fragmento específico que contiene el gen buscado.

HIBRIDACIÓN NORTHERN BLOT (con ARN)

Transferencia de RNA de un gel a un soporte sólido.

Como las moléculas de RNA son relativamente cortas (normalmente

Protocolo similar a Southern blot.

Nos permite comparar que en diferentes tejidos extraigo el ARNmensajero y veo si hay una expresión diferencial en otros tejidos por comparación entre ellos. Nos dice en que tejidos se expresa más o menos, a la hora de ver patrones de expresión.

APLICACIÓN: La hibridación de una sonda puede revelar el tamaño de una molécula de mRNA particular, su abundancia relativa o los tejidos en los que se transcribe (PATRONES DE EXPRESIÓN DE GENES ESPECÍFICOS).

INMUNOTRANSFERENCIA WESTERN (con proteínas)

Transferencia de la proteína de un gel a una membrana.

Las proteínas separadas por electroforesis se transfieren y unen a un filtro, que luego se incuba en una solución con un anticuerpo contra la proteína purificada en cuestión.

Se incuba con el anticuerpo específico de esa proteína, y para visualizar si se ha unido o no se usa una enzima cromogénica.

Se utiliza una enzima cromogénica para detectar el anticuerpo unido al filtro.

APLICACIÓN: determinar el tamaño de una proteína particular y supatrón de expresión.

6.SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

SECUENCIACIÓN DEL DNA

El principio básico de la secuenciación es la separación de los grupos de moléculas de DNA de acuerdo con su tamaño.

Secuenciar: conocer el orden de nucleótidos.

El método de secuenciación más usado: método de terminación de la cadena o método didesoxi (sanger).

Este método se basa en la replicación.

Tenemos una secuencia molde y queremos obtener la complementaria.

El fragmento que se va a secuenciar se utiliza como molde para sintetizar una serie de nuevas moléculas de DNA.

Se utilizan unos nucleótidos especiales: didesoxirribonucleósidos trifosfato (ddNTP) que son idénticos a los dNTP pero carecen del grupo 3′-OH. En lugar de añadir los dNTP añadimos ddNTP. La diferencia entre ambos es el extremo 3’, en los ddNTP les falta el grupo OH en el extremo 3’, como consecuencia no se podrá seguir con el método.

En el transcurso de la síntesis de DNA se incorporan los ddNTP y una vez que se han incorporado no pueden agregarse más nucleótidos.

Las muestras se dividen en 4 porciones que se colocan en tubos de reacción diferentes al que se le agrega: primer, dNTPs, un ddNTP diferente a cada tubo, DNA polimerasa.

La incorporación de ddNTP ocurre al azar en diferentes posiciones en las distintas copias: se genera un conjunto de cadenas de DNA de diferentes longitudes que se visualizan en geles de poliacrilamida.

Dibujar las bandas que deberían aparecer en el gel de poliacrilamida a partir de las cuatro reacciones de secuenciación del siguiente fragmento de DNA:

Los secuenciadotes automáticos parten de los mismos principios de la secuenciación de terminación de la cadena pero utilizan ddNTP marcados fluorescentemente (colores diferentes para cada ddNTP) y escáneres con láser.

Las cuatro reacciones de secuenciación pueden realizarse en el mismo tubo y colocarse en la misma calle para la electroforesis (tubos capilares).

Los fragmentos pasan por el láser, sus marcas fluorescentes se activan y la fluorescencia se detecta en un lector óptico.

PIROSECUENCIACIÓN

Se basa en la secuenciación por síntesis junto con una reacción quimioluminiscente.

Tienen lugar cuatro reacciones enzimáticas en un tubo en el que se monitoriza la síntesis de la cadena complementaria de DNA.

Enzimas:

– DNA polimerasa

– ATP sulfurilasa

-luciferasa

-apirasa

Se produce luz, de forma proporcional a la cantidad de nucleótidos incorporados.

La generación de luz se detecta en forma de pico y se graba gracias a un sistema de detección.

Reacciones enzimáticas:

1) DNA polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a la cadena de DNA molde. Si se incorporan se libera pirofosfato inorgánico (PPi) proporcionalmente a cantidad de dNTP.

2) ATP- sulfurilasa convierte cuantitativamente el PPi en ATP en presencia de APS (adenosina-5′-fosfosulfato).

3) El ATP permite conversión de luciferina en oxiluciferina por luciferasa y genera luz visible proporcional a la cantidad de ATP.

4) Apirasa degrada dNPS no incorporados.

APLICACIONES PRINCIPALES: Secuenciación de fragmentos cortos de DNA, detección de SNPs y análisis de metilación.

SECUENCIACIÓN DEL DNA

Programa informático para comparar secuencias: alineamiento de secuencias e identificación de polimorfismos/snps: BIOEDIT

¿Cómo interpretaríais este resultado de secuenciación de un fragmento de gen específico amplificado por PCR?

En la posición 201 presenta 2 picos. Se ha secuenciado por el método didesoxi, una lectura continua de picos, pero no nos indica proporciones. Lo que le pasa es que es heterocigoto para esa posición, su padre tenia una C y su madre una T

VECTORES

MÉTODO DE CLONACIÓN DE DNA BASADO EN CÉLULAS

Clonación de DNA: capacidad de formar moléculas de DNA recombinantes y mantenerlas en las células.

El proceso típico es el empleo de un VECTOR que aporta la información necesaria para propagar el DNA clonado hacia la célula (hospedador) y un INSERTO de DNA que se introduce dentro del vector y presenta el DNA en cuestión.

Base del procedimiento: crear moléculas recombinantes mediante el empleo de enzimas de restricción y otras enzimas que unen entre sí los fragmentos de DNA seccionados.

APLICACIONES:

Purificar un inserto determinado de DNA y aislarlo del resto

Amplificación de un fragmento de DNA para producirlo en grandes cantidades

VECTORES

Los vectores de DNA típicos tienen tres características:

1) Un origen de replicación que les permita replicarse en forma independiente del cromosoma del hospedador.

2) Algún tipo de marcador seleccionable que les permite identificar con facilidad las células que contienen el vector (junto con cualquier fragmento de DNA).

3) Sitios independientes para la unión de una enzima de restricción o varias. Permite la inserción de los fragmentos de DNA en un punto específico dentro de un vector íntegro. Como se conoce el genoma de los vectores sabemos donde de va a producir el inserto.

PLÁSMIDOS

Plásmidos = moléculas DNA circular (naturalmente en bacterias).

Se corta el DNA y el plásmido con la misma enzima de restricción y se mezclan.

La DNA ligasa sella las uniones en el esqueleto de azúcares fosfatados: plásmido recombinante.

El plásmido recombinante se introduce en células bacterianas mediante TRANSFORMACIÓN: capacidad de las células bacterianas de captar el DNA del ambiente externo, de forma natural o previo tratamiento químico o físico.

Los plásmidos se replican.

Las células que portan plásmidos recombinantes pueden detectarse mediante el empleo de marcadores

de selección:

Gen /acZ. Cuando se inserta DNA extraño en el sitio de restricción se altera el gen y la p-galactosidasa no se produce. Se añade X-gal en el medio de cultivo: -galactosidasa lo degrada y produce una sustancia de color azul.

¡¡¡CONTIENE PLÁSMIDO RECOMBINANTE!!!

Gen que confiere resistencia a un antibiótico (ampicilina). Se añade al medio de cultivo el antibiótico.

¡¡¡CONTIENE PLÁSMIDO!!

Las que no tiene el inserto tiene -galactosidasa…

OTROS VECTORES

Bacteriófagos = virus que infecta a bacterias.

Cósmidos = plásmidos empaquetados dentro de cápsides proteicas virales vacías.

Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son vectores inicialmente construidos a partir del plásmido F (plásmido especial que controla el apareamiento y la transferencia de material genético en algunas bacterias).

VECTORES DE EXPRESIÓN

Si el objetivo de la clonación génica es también producir la proteína que codifica se debe incluir el gen en un vector de expresión.

Contiene secuencias necesarias para la transcripción y la traducción en las células bacterianas.

OTROS VECTORES DE CLONACIÓN

Existen vectores de clonación que permiten la inserción de genes en células eucariontes.

Sirven para incluir modificaciones esenciales que deben sufrir las proteínas tras su traducción para ser funcionales.

YAC= cromosoma artificial de levadura. Es una molécula de DNA con un origen de replicación de levadura, un par de telómeros y un centrómero.

Los YAC son estables, se replican y segregan de la misma forma que los cromosomas de la levadura.

Pueden transportar fragmentos de DNA de 600 Kb.

GENOTECA

GENOTECA = colección de clones que contiene todos los fragmentos de DNA provenientes de una fuente.

1) GENOTECA GENÓMICA:cortarel DNA genómico con enzimas de restricción durante un período limitado (digestión parcial) para conseguir cortes en algunos sitios de restricción en cada molécula de DNA.

Se producen un conjunto de fragmentos superpuestos.

Número de clones elevado para contener una representación de todo el genoma (depende del vector).

2) GENOTECA DE cDNA:apartir de secuencias de DNA que se transcriben en mRNA. Es una genoteca de ADN complementario.

Ventajas:

Enriquecida con fragmentos de genes transcritos en forma activa.

Los intrones no interrumpen las secuencias clonadas (las bacterias no pueden eliminarlos).

Desventaja: contiene sólo secuencias que están presentes en el mRNA maduro y que se expresan en el tejido a partir del cual se aisló el RNA.

Requiere de un primer paso en el cual se separa el mRNA del resto.

COLONY BLOT

Las células se diluyen y se siembran en placa de manera que cada bacteria crezca en una colonia separada.

Cada placa o colonia bacteriana contiene un fragmento de DNA clonado que debe evaluarse para encontrar el gen de interés.

Las placas o colonias deben transferirse a membranas

La búsqueda en colonias se realiza mediante el empleo de sondas complementarias.

PROCESO DE OBTENCIÓN DE FÁRMACOS DE ORIGEN BIOTECNOLÓGICO

La mayoría de los fármacos tradicionales son compuestos orgánicos que contienenungrupo limitado de grupos funcionales.

Los fármacos obtenidos mediante procesos biotecnológicos son, sobre todo, las proteínas terapéuticas que pueden contener cientos de aminoácidos.

A los pacientes no les importa si el fármaco ha sido obtenido por medios químicos o biotecnológicos: SÓLO QUE FUNCIONE.

Los procesos de producción biotecnológicos son más complejos que los procesos tradicionales de producción de fármacos.

La mayoría de los fármacos elaborados mediante métodos biotecnológicos son proteínas que son altamente sensibles a cambios en su entorno.

Su estructura depende de diversas interacciones, a menudo débiles, entre los aminoácidos.

Estas interacciones están óptimamente coordinadas sólo en un margen estrecho de condiciones ambientales que corresponden precisamente a aquellas que se encuentran en el organismo del cual derivan las proteínas.

Incluso cambios relativamente pequeños en la temperatura, concentración de sales o pH de la solución pueden dañar la estructura y por tanto neutralizar la función de la proteína.

La mayoría de estas moléculas actúan como mensajeros químicos en el cuerpo.

Las células diana que reciben y traducen las señales tienen receptores especiales en su superficie en las cuales el correspondiente mensajero químico encaja perfectamente.

Si la estructura tridimensional del mensajero químico se altera ligeramente, la molécula no será reconocida por su receptor y será inactiva.

La situación es similar con otro grupo de proteínas terapéuticas: los anticuerpos.

En la biosíntesis natural de proteínas, en las células del cuerpo, una serie de enzimas se encargan de la correcta formación de las estructuras proteicas.

La producción de proteínas no puede realizarse mediante métodos químicos.

La mayoría de fármacos obtenidos mediante la aplicación de la biotecnología se producen en cultivos de microorganismos y células de mamíferos.

Cuando las sustancias constan de varias proteínas o sustancias que tienen que ser modificadas por adición de grupos no proteicos como cadenas de azúcares se deben emplear cultivos de células de mamífero.

Las células son organismos vivos y reaccionan incluso a pequeños cambios en su ambiente, no sólo a factores controlables como en la síntesis química convencional sino también a la solución de nutrientes y cualquier objeto o sustancia que entre en contacto con ellas.

Cada planta de producción biofarmacéutica es esencialmente única.

Los laboratorios y las empresas biotecnológicas trabajan con líneas celulares específicas que están muy estudiadas y susceptibles de estandarización.

Los investigadores biotecnológicos insertan genes estructurales y de control en las células de las líneas para producir el fármaco.

La nueva línea celular creada se trata normalmente como un secreto empresarial.

Se guardan como un banco celular que se conserva a bajas temperaturas (en nitrógeno líquido a -196°C para conservación a largo plazo).

El proceso de producción consiste en 4 pasos principales:

1) CULTIVO. Las células se transfieren del banco celular criogénico a un medio líquido con nutrientes que les permiten reproducirse.

La longitud de este paso depende del tipo de célula usada.

En condiciones favorables las células bacterianas se dividen una vez cada 20 minutos y las células de mamíferos se dividen una vez cada 24 horas.

Durante la fase de crecimiento el cultivo celular se transfiere a recipientes de cultivo de mayor tamaño progresivamente.

2) FERMENTACIÓN. El medio de cultivo contiene las sustancias necesarias para la síntesis de la proteína terapéutica deseada.

El medio de cultivo contiene alrededor de 80 constituyentes diferentes en esta etapa.

Los recipientes en los que tiene lugar la fermentación tienen capacidades de unos 10000 litros (limitaciones tecnológicas y biológicas).

3) PURIFICACIÓN.

Si las células cultivadas secretan el producto en la solución ambiente, se separan las células del medio de cultivo (centrifugación, filtración) y el producto se aisla tras varios pasos de purificación.

Si el producto permanece en el interior de lascélulas, las células se aislan, digieren y los desechos celulares se separan de la solución junto con el producto.

El rendimiento de procesos de bioproducción es generalmente menor que la síntesis química.

Tanto la purificación como el análisis de de cada lote de producto final duran varias semanas. Se requiere un nivel de pureza de 99,9 % para aprobación.

4) FORMULACIÓN.

Las proteínas sensibles se deben convertir en formas farmacéuticas estables y deben ser guardadas, transportadas y finalmente administradas en condiciones de seguridad.

A lo largo de estos pasos se debe salvaguardar la integridad estructural de la molécula para mantener su eficacia.

La naturaleza sensible de muchos fármacos de origen biotecnológico hace que se deban emplear soluciones especiales en las que el producto puede ser criogénicamente congelado y preservado.

La forma de administración de los mismos suele ser a través de soluciones inyectables (evita pH ácido de estómago y pueden atravesar la pared intestinal).

EJEMPLO DE MÉTODO DE PRODUCCIÓN DE INSULINA

El primer producto génico humano manufacturado utilizando DNA recombinante y con licencia para usos terapéuticos fue la INSULINA

HUMANA. N terminal

La subunidad A tiene 21 aminoácidos y la subunidad B tiene

Se utilizaron oligonucleótidos para construir genes sintéticos de las subunidades A y B (63 y 90 nucleótidos respectivamente).

La molécula de insulina madura consiste en dos cadenas polipeptídicas (cadenas A y B) unidas por puentes disulfuro.

Cada oligonucleótido sintético se insertó en un vector en una posición adyacente al gen que codifica la forma bacteriana de la enzima p-galactosidasa.

El producto es un polipéptido de fusión: secuencia aminoacídica de p-galactosidasa unida a la de una de las subunidades de la insulina.

Se purifican las proteínas de fusión de extractos bacterianos y se tratan con bromuro de cianógeno: corta la proteína de fusión produciendo p-galactosidasa y una de las subunidades de la insulina.

Cuando se mezclan las dos subunidades se unen espontáneamente formando una molécula de insulina intacta y activa.

MODIFICACIONES DE PROTEÍNAS

El incremento en la eficacia de las proteínas se puede conseguir con la ayuda de modificaciones específicas.

Un método para inducir modificaciones en proteínas es conocido como PEGILACIÓN.

El fármaco se envuelve en una o dos moléculas de PEG (polietilenglicol) que protegen al fármaco del sistema metabólico humano, prolongando así la actividad del mismo.

Ej: modificación del interferón-alfa-2a recombinante (fabricado a partir de E.coli) como tratamiento de hepatitis B y C.

Beneficios: el fármaco permanece activo durante más tiempo en el cuerpo, se puede reducir la dosis administrada y fluctúan menos los niveles del fármaco (efectos secundarios más tolerables).

BIOFÁRMACOS

DIFERENCIAS ENTRE BIOFÁRMACOS Y FÁRMACOS DE SÍNTESIS QUÍMICA

CARACTERÍSTICAS FARMACOCINÉTICAS DE LOS BIOFÁRMACOS

Cuando la cte de eliminación es mayor a la de absorción.

VENTAJAS/DESVENTAJAS DE BIOFÁRMACOS

1) VENTAJAS: EFICACIA Y SEGURIDAD

Gracias a su estructura, las proteínas tienen una afinidad fuerte por una molécula diana específica.

Son poco frecuentes la aparición de interferencias o interacciones peligrosas con otros fármacos, e incluso los efectos secundarios.

2) DESVENTAJAS:

Por su naturaleza, presentan una biodisponibilidad oral escasa.

Es más frecuente que desencadenen reacciones inmunes.

BIOFÁRMACOS EN ESPAÑA

Hasta el día 28 de febrero de 2011 estaban comercializados en España 85 principios activos farmacológicos de origen recombinante:

104 medicamentos

313 formatos

La mayoría están calificados como medicamentos hospitalarios.

Los grupos principales de biofármacos se incluyen en los siguientes grupos:

Anticuerpos monoclonales

citocinas -enzimas

Proteínas hormonales

Vacunas biotecnológicas

1. ANTICUERPOS MONOCLONALES

Son: anticuerpos que derivan todos de un mismo linfocito B.

Tipos: murinos, quiméricos y humanos.

Diferencias: en la región variable.

El inicio de la obtención de anticuerpos monoclonales frente a una proteína diana se realizó mediante la fusión de linfocitos B procedentes del bazo de ratones inmunizados con la proteína de interés, y una célula de mieloma (célula neoplásica de la misma estirpe que los linfocitos B).

La nueva célula se denominó HIBRIDOMA con propiedades:

Capacidad de producir el anticuerpo

Inmortalidad en cultivo

El uso clínico de los primeros anticuerpos monoclonales era mayoritariamente de origen murino (ratones).

Los anticuerpos de origen murino son capaces de desencadenar respuestas de anticuerpos humanos anti-Ig murinas: pérdida de eficacia y reacción inmunitaria generalizada.

Se han desarrollado nuevos tipos de anticuerpos monoclonales: anticuerpos recombinantes y fragmentos de anticuerpos (Fab).

En un anticuerpo quimérico las regiones variables provienen de una inmunoglobulina de origen murino, mientras que las regiones constantes tienen origen humano. Ej: infliximab.

En el desarrollo de anticuerpos humanizados(human-like): regiones hipervariables del anticuerpo murino entre las regiones de entramado de un dominio variable humano, generando un dominio variable híbrido, transfiriendo una especificidad de reconocimiento determinada a una molécula completamente humana en el resto de su secuencia.

En clínica también se utilizan:

FRAGMENTOS DE ANTICUERPO (Fab): moléculas completas de anticuerpo a las que se somete a determinados procesos químicos que eliminan selectivamente determinadas fracciones proteicas, dando lugar a moléculas más ligeras, menos inmunogénicas, más solubles, etc. Ej: bevacizumab.

PROTEÍNAS DE FUSIÓN: resultado de combinar partes de anticuerpos con fracciones peptídicas de determinados receptores biológicos o de sus correspondientes ligandos. Ej. abatacept.

La mayoría de los anticuerpos monoclonales están indicados en cuadros de artritis reumatoide o en neoplasias.

2. CITOCINAS

Las citocinas suelen ser moléculas peptídicas ligadas a cadenas glucídicas con el fin de incrementar su estabilidad y solubilidad en el medio extracelular.

Se trata de moléculas con elevada actividad biológica pero con una duración de efectos muy breve (degradación por proteasas).

Ejercen sus funciones reguladoras mediante la unión a receptores en la superficie de las células diana y, mediante señalización celular, activan una serie de factores de transcripción para que se transcriban unos genes concretos cuyos productos son los que ejercen el efecto biológico correspondiente.

Entre las citocinas:

FACTORES ESTIMULADORES DE LA FORMACIÓN DE COLONIAS (CSF) que afectan al crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas.

EPOETINA (eritropoyetina de origen recombinante): factor estimulante de la diferenciación y maduración de los precursores de eritrocitos.

IMPORTANTE: los receptores biológicos de la eritropoyetina pueden expresarse también sobre la superficie de diversas células tumorales y existe riesgo de trombosis: se ha cuestionado su utilización en pacientes con cáncer.

INTERLEUCINA: parte esencial del sistema inmunitario (intercomunicación entre subpoblaciones de leucocitos) y también efectos indirectos sobre crecimiento y diferenciación celular hematopoyética. Hasta el momento se comercializa una forma recombinante de interleucina 2.

INTERFERONES. Los de tipo I (alfa y beta) con efectos antivirales y antiproliferativos y el tipo II (gamma) con propiedades

inmunomoduladoras.

Interaccionan con receptores de membrana pero el efecto ocurre en el núcleo mediante regulación de expresión de determinados genes y la represión de otros.

FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (TNF): hace referencia a la capacidad de esta citocina para provocar necrosis en algunos tumores pero participa también en la respuesta inmunitaria.

El único utilizado por el momento con fines terapéuticos es el TNF-alfa.

3. ENZIMAS

Enzimas empleadas en TERAPIAS DE RESTAURACIÓN: tratamiento de cuadros de deficiencia congénita o adquirida de determinadas enzimas implicadas en pasos metabólicos específicos.

ENZIMAS ANTITROMBÓTICAS. Enzimas recombinantes que tienen por misión estimular el sistema fibrinolítico endógeno.

En cuanto a la especificidad, los agentes antitrombóticos pueden ser clasificados principalmente en: agentes inespecíficos o fibrinolíticos (estimulan la fibrinolisis donde existe plasminógeno) y los específicos o trombolíticos (activan la fibrinolisis donde hay fibrina).

FACTORES DE LA COAGULACIÓN SANGUÍNEA. Las formas recombinantes no presentan ventajas adicionales frente a productos obtenidos mediante extracción salvo la disponibilidad y la reducción del riesgo de contaminación biológica.

4. PROTEÍNAS HORMONALES

INSULINA. Todas las insulinas comercializadas tienen un origen biotecnológico.

Modificaciones en la estructura molecular de la insulina pueden adelantar el comienzo de la acción y emular el perfil cinético de la insulina fisiológica o producir un efecto mantenido a lo largo de más tiempo (liberación más lenta).

GONADOTROPINAS HIPOFISARIAS. Hormonas de naturaleza glucoproteica que actúan en la iniciación y regulación de la gametogénesis.

PROTEÍNA OSTEOGÉNICA 1: induce la formación de nuevo hueso fisiológicamente normal.

HORMONAS SECRETADAS POR EL LÓBULO ANTERIOR DE LA HIPÓFISIS:

La SOMATOTROPINA tiene un origen recombinante en todos los fármacos comercializados.

La HORMONA PARATIROIDEA ó PARATHORMONA (PTH) como estimuladora de la formación ósea.

5. VACUNAS

Sólo una pequeña minoría de las vacunas comercializadas en

España son recombinantes.

Para virus que el sistema inmune no es capaz de eliminar totalmente en ocasiones, cronificándose la infección y con potencial tumoral que se puede manifestar a largo plazo.

Crecen mal en cultivos de tejido.

VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB). La partícula infectiva tiene forma esférica y presenta una capa lipídica externa en la que se insertan múltiples copias de la proteína viral, que es el antígeno de superficie para proteger frente a la infección clínica del VHB.

VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO. Presenta una capa externa formada por dos proteínas: L1 y L2. La L1 es la proteína más importante para inducir la respuesta inmunitaria protectora.

FÁRMACOS BIOSIMILARES

Las copias de los fármacos biotecnológicos se conocen como BIOSIMILARES.

Son producidos por un fabricante diferente del original, utilizando nuevas líneas celulares, nuevos procesos y nuevos métodos analíticos.

Pueden existir diferencias en cuanto al producto final que ocasionen ciertas características específicas a nivel de la actividad del medicamento o la aparición de determinados efectos adversos por la inmunogenicidad que pueden desarrollar.

Ej: diferencias en la glucosilación de las epoetinas (eritropoyetinas) biosimilares pueden ocasionar diferencias de hasta un 20% en la actividad con respecto al original porque la glucosilación determina la actividad biológica de la proteína.

OTRAS APLICACIONES DE BIOTECNOLOGÍA: PRUEBAS GENÉTICAS

MICROSATÉLITES-PATERNIDAD

Los marcadores microsatélites también se conocen como STRs (Short Tandem Repeats).

Se emplean comúnmente en la identificación humana debido a que son muy polimórficos (gran poder de discriminación), tasa de mutación relativamente baja, tamaño pequeño y ubicación cromosómica establecida.

Varios de estos marcadores pueden amplificarse mediante PCR de forma simultánea (multiplex).

El CODIS (Combined DNA Index System), es la base de datos de DNA creada por el FBI (USA).

El CODIS utiliza un conjunto estándar de 13 regiones STRs específicos.

AMELOGENINA Discriminación del sexo

MICROSATÉLITES-PATERNIDAD Número de alelos para cada locus STR del CODIS

ACTIVIDAD MICROSATÉLITES-PATERNIDAD

Primer paso: Elaboración del árbol genealógico de una familia

Segundo paso: Recopilación datos análisis STR

Ejercicio: recopilar la información de los 3 marcadores para todos los individuos de la familia de Bob.

Ejercicio1 : Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina, ¿apoyan todos los datos sobre los genotipos de Bob, Ana, María, y David la posibilidad de que Bob y Ana son los padres biológicos de María y David?

Ejercicio 2: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Los alelos que Bob transmite a sus descendientes los heredó a su vez de Alfredo y Nuria. Identificar los alelos de los genotipos de María y David que se han heredado sin ambigüedad de cada uno de sus abuelos paternos.

Ejercicio 3: Con la información de los 13 marcadores y la amelogenina. Si no se conoce el perfil genético de Esteban pero se sabe con certeza que es el padre de Teresa, Mónica y Esther junto con su mujer Luisa, ¿qué predicciones podríamos hacer acerca de su composición para cada uno de estos marcadores?

CLONACIÓN DE ORGANISMOS

«Desde el punto de vista genético un clon no es otra cosa que un gemelo que viene al mundo con retraso» (Jens Reich).

Primeros animales en ser clonados: ranas.

Primer mamífero clonado: DOLLY en el Instituto Rosalina (Escocia).

Procedimiento:

– Extracción de células de glándula mamaria de oveja

– Cultivo celular

– Núcleos celulares se inyectan en óvulo enucleado de otra raza de oveja

– Desarrollo embrionario que da lugar a oveja clonada (Dolly: 5 de julio de 1996)

Dolly: clonación a partir de una célula de glándula mamaría por transferencia de su núcleo a un óvulo enucleado.

CONCLUSIONES:

Una célula somática puede «olvidar» todas las especificidades (diferenciación) y actuar como si fuera un óvulo fecundado «totipotente».

Procedimiento poco eficiente: la mayoría de ovejas gestantes tuvieron abortos.

Se ha descubierto que algunos animales clonados poseen telómeros más cortos que sus congéneres de la misma edad.

DIFICULTADES:

– El núcleo celular procede de una célula corporal diferenciada, en la cual ciertos genes están bloqueados. Para poder reprogramar el DNA bloqueado se deben mantener los núcleos de las células somáticas en un medio de cultivo pobre en nutrientes.

– El núcleo celular del donante está dañado de antemano por la luz UV, radicales de oxígeno reactivo (ROS) y sustancias tóxicas.

– La interacción entre óvulos enucleados y núcleos celulares no funciona sin fallos. El plasma celular del óvulo controla la función del núcleo celular correspondiente.

– El clon no es una copia exacta del donante: el DNA mitocondrial procede de la donante de óvulos. Clon genómico.