Generación de diversidad inmunitaria

Linfocitos:
Reconocen muchos Ag. Gran diversidad de Ig Linfocitos B.
Gran diversidad de TCR de los Linfocitos T.
Diferencias estructurales y moleculares entre Linfocitos pero proceso generación variabilidad prácticamente iguales.

Repertorio anticuerpos

Suma total anticuerpos individuo. 

Origen variabilidad

En la organización de los genes que codifican Ig y sus cadenas ligeras y pesadas. La recombinación en los fragmentos génicos aleatoria en la maduración de los linfocitos
B esta la variabilidad. 

1.Diversidad asociada a linfocitos b

1.1 Diversidad segmentos génicos que codifican Ig:

Genes Ig

Tres loci diferentes.

Locus cadena pesada:

cromosoma 14.

Locus cadena ligera

Cromosoma 2 y 22.

GENES C

Dentro de cada uno de los genes de las cadenas ligeras y pesadas existen diferentes segmentos génicos que codifican para las regiones variables y constantes.

LOCUS CADENA PESADA

Regiones del genoma que codifican para producir cadenas pesadas.

Regíón variable (V, D, J).

Genes constantes de los diferentes isotipos de Ig dispuestos de forma secuencial. (C)

LOCUS CADENA LIGERA

Cadena ligera
  Un solo segmento constante CK

Cadena ligera   Al menos 6 (funcionalmente no hay diferencias entre ellos)

DOMINIOS CONSTANTES

En cada gen de las cadenas ligeras y pesadas cada dominio constante está codificado por un EXÓN.

DOMINIOS VARIABLES

Codificados por:

Dos segmentos génicos (VL)  GENES VARIABLES (V) y DE UníÓN (J)

Tres segmentos génicos (VH)  Anteriores + SEGMENTO DE DIVERSIDAD (D)

Hay múltiples versiones de cada uno de estos segmentos génicos y cada linfocito
B expresará de forma ALEATORIA cualquiera de las versiones disponibles que codifican para cada regíón variable.

La existencia demúltiples versiones de los diversos segmentos génicos que se reordenan de forma aleatoria es el mecanismo principal de generación de diversidad de BCR.  Linfocitos B

SEGMENTOS V

Codifican la mayor parte del dominio variable de las Ig también las 3 regiones HIPERVARIABLES (cadenas L y H)

1a y 2a Regíón Hipervariable: Las Diferencias entre ellas se deben a diferencias en la secuencia de los segmentos génicos V.

3a Regíón Hipervariable: Determinada por la uníón de segmentos V, D y J.

1.2 Recombinación somática

Los precusores de los linfocitos B reordenan los segmentos génicos de las Ig para ensamblar moléculas funcionales.

Los segmentos génicos que codifican las regiones variables de las Ig se encuentran muy separados en el genoma de todas las células del organismo salvo en los linfocitos B.

Causa

En el desarrollo de los linfocitos B en la médula los segmentos VDJ se yuxtaponen por recombinación somática.

Implica

Corte DNA

Empalme de diferentes segmentos

Múltiples versiones de cada segmento  Múltiples combinaciones  Elevado número de regiones variables diferentes.

Cadena ligera es codificada por la combinación de un segmento génico

V y uno J.

La regíón constante es codificada por un solo gen C.

En la cadena pesada también se produce el reordenamiento génico durante la maduración de la célula B.

1) Aproximación segmentos D y J

2) La regíón V se recombina con el segmento DJ reordenado, generándose una combinación VDJ

La diversidad potencial de cadenas pesadas por combinación al azar de segmentos VDJ es > 9000.

Ig = Combinación de cualquiera de las variedades de cadena ligera y pesada

Diversidad combinatorial  > 4 millones de Ig diferentes.

1.3 Control de la Recombinación somática

Recombinasas

Enzimas que realizan la recombinación somática del ADN.

Aproximan los segmentos mediante un lazo que es cortado, escindido para su empalme en el DNA.

La recombinación de los segmentos VDJ está dirigida por secuencias muy conservadas que flanquean los diferentes segmentos génicos = SEÑALES DE RECOMBINACIÓN.

Formada por una secuencia conservada de 7 pb (HEPTÁMERO)

Y otra de 9 pb (NONÁMERO)

Separadas por una RegíÓN ESPACIADORA no conservada de 12 o 23 pb.

La longitud de la regíón espadadora es muy importante para que la recombinación somática se realice de forma ordenada (VDJ).

La secuencia señal que tiene un separador de 12 pb y sólo se puede unir a un espaciador de 23

pb.

Secuencias espaciadoras:

Situadas de forma alterna en los segmentos génicos.

En una cadena pesada no puede producirse una recombinación VJ porque ambas regiones están flanqueadas por espaciadores 23 pb.

Pueden recombinarse con los segmentos D flanqueados por espaciadores 12 pb.

En el proceso de recombinación somática:

Genera diversidad

Es imprescindible para que se expresen las Ig

La recombinación del DNA permite la transcripción de sus genes producíéndose un transcrito primario (con intrones y exones) posteriormente procesado y traducido a proteínas.

Ig  codificadas como proteínas de membrana (parte del BCR).

El extremo carboxilo de la cadena pesada se continúa con una regíón transmembrana (aminoácidos hidrofóbicos).

Linfocitos B + Ag  célula plasmática

Regíón transmembrana: es remplazada (procesamiento alternativo del RNA) por una secuencia de aa hidrofílicos  secreción al exterior celular = Ac.

1.4 Diversidad de uníón

Mecanismo de generador de variabilidad adicional a la recombinación somática.

Imprecisión recombinasas al cortan el DNA -> puede cambiar la pauta de lectura e introducir distintos aa en la proteína.

Los nucleótidos «arrastrados» durante la recombinación somática entre las regiones VDJ =

NUCLEÓTIDOS P

Pueden modificar la pauta de lectura del segmento D o J que les sucede.

Originan diversidad en cadenas pesadas y ligeras.

Antes de que se religue el ADN en las uniones VD y DJ (sólo en cadenas pesadas) una ADN polimerasa DEXOSINUCLEOTIDIL TRANSFERASAS TERMINAL (TdT) añade sin molde y al azar unos pocos nucleótidos extra.

Nucleótidos extra = NUCLEÓTIDOS N

No son codificados en la línea germinal

Su incorporación genera variabilidad.

1.5 Exclusión alélica

1 Linfocito B  s1 tipo de Ig  1 versión de cadena pesada y ligera.

Ac  2 sitios de uníón al Ag idénticos

Una sola especificidad antigénica

¿Por qué solo se expresa un receptor en cada linfocito B capaz de reconocer sólo un antígeno a pesar de tener dos sitios de uníón?

Dos genes para cada cadena de la Ig (uno por cromosoma) pero sólo uno es reordenado y expresado por la célula.

Tras un reordenamiento efectivo (en la cadena ligera o pesada) cesan los intentos de reordenamiento.

Exclusión alélica

El proceso de exclusión alélica es el responsable de la monoespecificidad del reconocimiento de Ag por el linfocito.

Linfocito B  Responde sólo a un tipo de Ag Ac anti Ag

Médula ósea, precursores linfocitos B comienzan reordenando la cadena pesada.

Recombinación segmentos VDJ de forma productiva  precursores comienzan a expresar la cadena pesada g en la superficie celular.

Especie humana  genes constantes de los diferentes isotipos ordenados de forma secuencial (C C C C C) después de los segmentos variables. * El gen C es el más próximo a los segmentos variables.

En los estadíos iniciales de maduración no se expresan las cadenas ligeras.

La cadena g se une a una cadena monomórfica ligera formada por dos proteínas VpreB y 5 similares a las cadenas ligeras.  PreBCR en células Pre-B

La expresión del PreBCR induce:

1) La proliferación celular

2) La inhibición del reordenamiento de cadenas pesadas del otro cromosoma (exclusión alélica)

3) Inicio del reordenamiento de las cadenas ligeras

Comienza una segunda etapa en la que la primera cadena ligera que se logra sintetizar desplaza a VpreB y a 5 del preBCR formando el BCR definitivo  LINFOCITO B INMADURO

Las señales recibidas a través del BCR inhiben el reordenamiento de otras cadenas ligeras

Garantiza la exclusión alélica

Inducen la maduración a Linfocito B maduro que empieza a expresar en su superficie simultáneamente IgM e IgD.

IgM e IgD

La misma regíón variable

Expresan distinta regíón constante (C o C) por procesamiento alternativo del transcrito primario de RNA.

1.6 Hipermutación somática

Tiene lugar en los órganos linfoides secundarios tras la activación del linfocito B.

Introducción por azar de mutaciones puntuales únicamente en los dominios variables (cadenas pesada y ligera)

Sólo en las regiones variables del cromosoma que ha reordenado sus genes para las Ig de forma productiva.

Las mutaciones pueden alterar la secuencia de aa de la regíón variable — cambios de la afinidad de la Ig por el antígeno.

Maduración de la afinidad:

Selección de los clones con Ig más afines por el Ag

El contacto con el antígeno puede producir el cambio de isotipo de Ig que expresa.

¿Cómo?

Reordenamiento adicional entre los segmentos VDJ reordenados de la cadena pesada con cualquier segmento génico CK

Linfocitos B dejan de expresar IgM y empiezan a expresar IgG, IgA o IgE.

El cambio de isotipo no afectan a la regíón variable — no afectan a la especificidad antigénica del linfocito.

Eliminación de linfocitos b autorreactivos

El mecanismo aleatorio de generación de diversidad puede crear Ig frente a Ag propios.

Hay diversos mecanismos para eliminar/inactivar estas células.

Tolerancia central

En la médula ósea durante la maduración de los linfocitos B

Si los linfocitos B inmaduros interaccionan con moléculas abundantes en su entorno son eliminados o inactivados.

Asegura la tolerancia a lo propio

Proceso se denomina Selección NEGATIVA hay dos mecanismos:

Apoptosis si los antígenos reconocidos son moléculas multivalentes de la superficie celular, por ej. Antígenos ABO

Inactivación por anergia si reconocen antígenos pequeños solubles

Sólo los linfocitos B IgM+ que no reconocen ningún antígeno a nivel de la médula ósea continúan su proceso normal de diferenciación expresando IgM e IgD y migrando hacia los tejidos linfoides secundarios.

Tolerancia periférica

Los linfocitos B potencialmente reactivos que no son eliminados en la médula ósea pueden serlo en la periferia por distintos mecanismos.

2

Diversidad asociada a linfocitos t

Los genes que codifican el TCR tienen múltiples versiones

Los linfocitos T portan un receptor específico para el antígeno TCR/CD.

TCR molécula de membrana constituida por dos cadenas heterodiméricas.

Según estas se definen dos tipos de TCR  o 

Millones de linfocitos T diferentes  gran variedad de antígenos.

Prácticamente los mismos mecanismos de variabilidad que linfocitos B.

Las regiones variables de los genes que codifican para TCR, TCR, TCR y TCR están codificadas en pequeños segmentos VDJ que deben ensamblarse para generar una regíón variable funcional.

El proceso se realiza durante la maduración de los timocitos en el timo.

De estos segmentos hay diferentes versiones  TCR de cada linfocito T expresará aleatoriamente cualquiera de ellas.

Este fenómeno es el primer responsable de la diversidad de los TCR.

1 Diversidad de segmentos génicos

Mecanismos por los que se genera la diversidad del TCR:

2) Recombinación somática

Múltiples versiones de los segmentos V, D, J y C en los genes de las cadenas TCR. Mediante recombinación somática los timocitos unen aleatoriamente diferentes versiones de V, D y J para generar cada dominio variable.

Ej: TCR  75 versiones V, 2 de D, 12 de J y 2 de C= 3600 cadenas posibles.

3) Imprecisión en las uniones de los segmentos de ADN

De las regiones VDJ.

La doxirribonucleotidil transferasa se expresa en los timocitos y añade NUCLEÓTIDOS N al azar entre los segmentos V, D y J.

En algunos casos incluso se eliminan segmentos al azar o se producen uniones VJ.

4) El reordenamiento del TCR también induce la transcripción de sus genes producíéndose un transcrito primario que será procesado y traducido.

La traducción a ARN lleva a la expresión de una molécula de TCR única en la superficie del linfocito ( o )

5) La uníón de las dos cadenas que constituyen el receptor ( o ) aumentan la diversidad

Ejemplo: 3600 TCR + 3600 TCR = + 12 millones de TCR sin contar con la diversidad por la flexibilidad de uníón VDJ.

No generan diversidad adicional por hipermutación somática

Linfocitos B  reconocen Ag solubles

Linfocitos T  sólo reconocen péptidos presentados por moléculas MHC

Muchos TCR generados al azar no serán funcionales por no poder reconocerlas.

15 15 especificidades

En el timo se seleccionan positivamente sólo una parte (reconocen MHC)

Se eliminan los timocitos potencialmente autorreactivos.