FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE:

1.-Introducción:

Las Enterobacterias están ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitando plantas, suelos y animales.-.-.-.En el hombre se encuentra formando parte de la flora comensal del intestino, produciendo en muchas ocasiones efectos patógenos de gravedad variable. Son responsables de un gran número de infecciones.-.-.En muchos casos las Enterobacterias se pueden comportar como potencialmente patógenas, es decir, cuando las condiciones del huésped se lo permiten (bajas defensas) originando numerosas infecciones tipo oportunista.

2-CarácterÍSTICAS:

__Bacilos rectos gram negativos, no esporulados.__Anaerobios facultativos__Oxidasa negativo.__Catalasa positivo.__Son fermentadoras de la glucosa con o sin producción de gas.__Moviles(flagelos peritricos) o inmóviles.__Reduccion de los nitratos.

MEDIOS DE CULTIVOS

En general crecen bien en medios de cultivos ordinarios , pero para su aislamiento a partir de muestras patológicas se suelen utilizar medios selectivos y diferenciales:

Cled:

medio ordinario diferencial,enriquecido.El menos diferencial.Pueden crecer G+yG-.Se parte de color verde

.Agar MacConkey:

Inhibe el crecimiento de los gram positivos y contiene lactosa para diferenciar entre los fermentadores de este azúcar.Si hay crecimiento,diremos crecimiento gram – .Se parte de color rojizo sales biliares y cristal violeta. Medio diferencial(dif lactosa+de lactosa-.

Lactosa positiva

Colonias rosas.

Lactosa negativa

Colonias incoloras.

Agar Levine (EMB):

Eosina y azul metileno.Inhibe el crecimiento de los gram positivos y contiene lactosa para diferenciar entre los fermentadores de este azúcar.Medio diferencial,diferencia lactosa+ de lactosa-.Se parte de color rojo-anaranjado.

Lactosa positiva fuertes

C. Negro verdoso, con brillo metálico cuando existe mucho crecimiento-

Coliformes

.

Lactosas positivas débiles

C. Púrpuras.

Lactosa negativa

Colonias incoloras.

Agar Hektoen(HE):

Inhibe crecimiento de gram positivos y retarda el de coliformes. Permiten el aislamiento y diferenciación de Salmonella y Shigella.Partimos de color verde.

Lactosa positiva

Colonias naranjas.

Lactosa negativa

Azul- verdosas.Genero salmonella o proteus.__Salmonella: colonias con punto negro.__Shigella: colonias verdosas.

Agar Salmonella-Shigella (SS

Inhibeel crecimiento de gram positivos y la mayoría de coliformes.Permiten el aislamiento y diferenciación de Salmonella:c. Transparentes con punto negro y Shigella: c.Sin color.

Agar verde brillante

Permitenel aislamiento y diferenciación de Salmonella y Shigella, excepto S.Typhi.

Caldo selenito

Para enrequecimiento de Salmonella.

Caldo tetrationato:

Para enrequecimiento de Salmonella y Shigella.

3-FERMENTACIONES DE LAS ENTEROBACTERIAS:

Una de las carácterísticas taxonómicas claves que separa los diversos de este grupo, es la variedad y proporción de los productos finales resultante de la fermentación anaerobia de la glucosa. Se conocen dos amplios sistemas:—

Fermentación ácido mixta

Cuyos productos finales son ácido láctico, etanol y fórmico.—

Fermentación butilenglicólica

Cuyo producto final es la acetoína…

GLUCOSA

> ÁCIDO PIRÚVICO->

Fermentación butilen glicólica

–
>Acetoína -> (Prueba Voges-Proskauer) -> Fermentación ácido-mixta ->

Ácidos mixtos ->(Prueba Rojo metilo).

4-INTERÉS CLÍNICO DE LAS ENTEROBACTERIAS: ACCIÓN PATÓGENA:

El interés clínico estriba en su mayor o menor acción patógena, que va a depender de los siguientes factores:

Antígenos estructurales,

Antígeno O o somático (polisacárido de la pared celular).·

Antígeno H o flagelar (proteína)(da+capacidad antigenica según la cap del mismo).·

Antígeno VI o K, que es un antígeno capsular termolábil que se presenta especialmente en las especies de S. Typhi y S. Paratyphi y le confiere un poder frente a los ácidos(aumenta su virulencia), además de propiedades de resistencia en general y antifagocitarias.

Endotoxinas

productos tóxicos que son vertidos al medio externo solamente cuando la bacteria muere, son responsables en muchos casos de alteraciones vasculares y fiebre. Las colicinas tiuenen propiedades bactericidas.

Exotoxinas:

productos tóxicos que son vertidos al medio externo por parte de la bacteria ejerciendo una acción altamente tóxica y directa sobre las células, ejemplo de la toxina de la Shigella que produce citotoxicidad a nivel del epitelio intestinal.

Dentro de las Enterobacterias con interés clínico distinguimos:__

Enterobacterias asociadas a infecciones gastrointestinales y fiebre entérica, patógenas para el hombre.

Enterobacterias oportunistas

Este tipo de bacterias suele formar parte de la flora Gram – del tubo digestivo como saprófitos y en algunas ocasiones podrían comportarse como patógenos, siempre y cuando aparecieran factores debilitantes en el huésped; en estos caso podría originar infecciones gastrointestinales, infecciones urinarias, supurativas, etc.

Poder patógeno:

1.-Mecanismo invasor.2.-Mec. Toxigenico:exotoxinas(entorotoxinas).3.-Endotoxins:hock endotoxico.(reponsable de alteraciones vasculares y fiebre).

7- IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS:

1-PRUEBAS PRESUNTIVAS:son las pruebas que me hacen sospechar de una Enterobacteria, si estas son positivas procedo con las pruebas definitivas que me darán la identificación de la bacteria:__Tinción de Gram:
gram negativos, bacilos o cocos bacilos cortos.__Características de la colonia.__Crecimiento y carácterísticas en ciertos medios de cultivos

2-PRUEBAS DEFINITIVAS:

Requiere una batería de pruebas bioquímicas, pero anteriormente deben realizarse unas pruebas preliminares para asegurarse de que el microorganismo pertenece a este grupo. La bacteria tiene que dar en las siguientes pruebas:__Fermentación de la glucosa +.__Citocromo oxidasa -.__Catalasa +.__Reducción de nitritos a nitratos +.

REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS:

FUNDAMENTO:

Algunos MO anaerobios o anaerobios facultativos, utilizan nitrato como último aceptor de electrones en su metabolismo, este proceso de reducción es catalizado por el enzima nitrato reductasa, pudiendo generar diversos productos finales:- nitritos.- nitrógeno molecular.- otros productos nitrogenados (Amóníaco, óxido nítrico, óxido-nitroso o hidroxilamina).

Técnica:

Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfanaftillamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rojo. Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido a nitrógeno molecular porque produce gas. Si no se observa ningún cambio, añadimos zinc en polvo si no hay color rojo es que no hay nitratos porque el zinc solo reacciona con los nitratos y no con otros compuestos nitrogenados.

3-OTRAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

1- PRUEBA DEL CITRATO DE SIMMONS:

FUNDAMENTO:

Sirve para detectar bacterias que utilizan el citrato como única fuente de carbono, en un medio de cultivo donde el citrato es la única fuente de carbono. Estas bacterias al usar el citrato alcalinizan el medio debido a la formación de NH3 produciendo el viraje del indicador ( azul de bromotimol, que es de color verde a pH neutro y azul por arriba de 7,3).

TÉCNICA:

1- Preparar dos tubos con el medio.2- Inocular uno de ellos , el otro sirve como control negativo.3- Incubar 48-72 horas a 37ºC con los tubos destapados para que el CO2 se desprenda libremente.4- Leer como mínimo después de 48 h de incubación.

RESULTADOS:

Citrato positivo: crecimiento con un color azul intenso en la superficie del medio.

Citrato negativo:

no se observa crecimiento ni cambio de color.

2- PRUEBA DEL INDOL:

FUNDAMENTO:

Determina la capacidad de desdoblar el indol de la molécula del triptófano, mediante la enzima triptofanasa.

TÉCNICA:

1- Sembrar en el tubo de agua de peptona.2- Incubar a 37ºC durante 24-48h.3- Agregar 5 gotas de reactivo de Kovacs al medio.4- Agitar suavemente el tubo y dejarlo reposar unos minutos.

RESULTADOS:

Indol positivo: aparición de un anillo de color rojo en la superficie del medio.

Indol negativo:

la superficie del medio toma el color amarillento del reactivo añadido.

3- PRUEBA DE LA UREASA

FUNDAMENTO:

La hidrólisis de la urea es catalizada por un enzima específico,la ureasa, dando carbonatoamónico como producto final, lo cual hace que vire el indicador de pH del medio (rojo fenol que es amarillo a pH ácido y rosa a pH básico).-.-..La prueba de la ureasa se utiliza para la detección de la producción de este enzima por parte de un MO…..Se aplica a la diferenciación de :- Proteus (rápidamente positivo) de otras Enterobacteriaceae (negativo o positivo retardado)- Bordetella pertussis (-) de B. Parpertussis (+) y B. Bronchiseptica(+)- Yersinia pestis (-) de Y. Pseudotuberculosis (+) y Y. Enterocolitica (+).

TÉCNICA:

1-Inocular a partir de un cultivo puro la superficie de un tubo con agar urea de Christensen inclinado. No sembrar la capa profunda porque servirá de control de viraje.2-Incubar a 37ºC hasta detectar el cambio del indicador, si no se produce cambio en 6 días la prueba se da como negativa.

RESULTADOS:

Ureasa positivo:color rojo rosado en la superficie del agar inclinado. Si se da antes de 6 días es positiva rápida.

Ureasa negativo:

no se produce viraje del indicado.

4- PRUEBA MANITOL MOVILIDAD

FUNDAMENTO:

El medio manitol-movilidad es un medio especialmente formulado par verificar la movilidad y fermentación del manitol en las enterobacterias de forma común a todas ellas.

Este medio nos permite estudiar dos carácterísticas:

Por la fluidez del medio permite un libre desplazamiento de las bacterias y se observa fácilmente por la nitidez de la picadura. Si el gérmen es inmóvil la picadura permanece limpia y nítida. Pero si la bacteria es móvil el medio se enturbia homogéneamente debido al reparto al azar de las bacterias.- Fermentación del manitol que lo observaremos por el viraje de color del indicador de pH pasando de rojo a amarillo en caso de fermentar el manitol, ya que el indicador utilizado es el rojo fenol .

Técnica:

1º- Prepar dos tubos con agar manitol- movilidad.2º- A partir de un cultivo joven y puro del microorganismo problema, se toma muestra con hilo.3º- Se siembra con el hilo de platino cargado de gérmenes haciendo una picadura central hasta el fondo del medio, mientras mientras que el otro se punciona con el hilo estéril, con lo que actuará como control negativo.4º- Incubar a 37ºC durante 48h.

RESULTADOS E Interpretación:

Movilidad- inmovilidad: según queden los microorganismos circunscritos a lo largo de la siembra o difundan por todo el medio

.- Fermentación o no del manitol

Según se produzca o no el viraje a amarillo.

5- PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER:

FUNDAMENTO

Sirve para detectar bacterias que fermentan la glucosa mediante un metabolismo fermentativo de tipo butilen-glicólico, es decir como producto final se obtiene la acetoina.-.-.La acetoina se pone de manifiesto al oxidarse a diacetilo con KOH, combinándose a continuación con alfa- naftol para dar un compuesto coloreado.

TÉCNICA:

1- Sembrar el MO problema en un tubo con medio de Clark y Lubs.2- Incubar de 48 a 72 h a 37ºC.3- Agregar al cultivo en el siguiente orden los reactivos:a) 0,5 ml de la solución alfa- naftol.B) 0,5 ml de la solución de hidróxido potásico.4- Agitar el tubo suavemente y mantenerlo inclinado, casi horizontal con el fin de favorecer la oxidación de la acetoína por el oxígeno atmosférico.5- Dejar reposar el tubo, al menos 10-15 minutos antes de interpretar la prueba.

RESULTADOS

VP + :

coloración rojo rosada en la superficie del medio, aparecida antes de una hora.

VP – :

la superficie del medio queda de color amarillento.

6- PRUEBA DEL ROJO DE METILO

FUNDAMENTO

Sirve para detectar bacterias que fermentan la glucosa mediante un metabolismo fermentativo de tipo ácido-mixto, formando como productos finales: ac. Láctico, ac. Fórmico y etanol con lo que el pH del medio disminuye y al añadirle un indicador (rojo de metilo) aparece un color rojo.

TÉCNICA:

1- Sembrar el MO problema en un tubo con medio de Clark y Lubs.2- Incubar de 48 a 72 h a 37ºC.3- Agregar al cultivo 5 gotas de la solución de rojo de metilo.4- Leer el resultado.

RESULTADOS

RM+:aparece color rojo intenso en la superficie del medio.

RM-:

la superficie del medio queda de color amarillento.

9- SISTEMAS MULTIPRUEBAS

Existen diversos medios de composición compleja y sistemas comerciales que permiten realizar varias pruebas bioquímicas simultáneamente y me permite una más rápida identificación del microorganismo:

KLIGLER (AHK):

Es un medio de cultivo que permite la realización de cuatro pruebas bioquímicas simultaneas:- utilización de azucares: glucosa y lactosa – producción de gas – producción de ácido sulfhídrico.-.-.-.Su principal aplicación es la identificación de Enterobacterias,todas las enterobacterias fermentan la glucosa y nos permite dividirlas en dos grandes grupos según su capacidad de metabolizar o no la lactosa.

FUNDAMENTO:

Para realizar la prueba nos basamos en algunos aspectos del metabolismo de las Enterobacterias y demás microorganismos:__1º- Las Enterobacterias utilizan los hidratos de carbono con formación de ácidos orgánicos y con la consecuente acidificación del medio de cultivo.__2º- El orden de utilización de los hidratos de carbono serán de los más simples a los más complejos (Glucosa —- Lactosa).-_-Por ello se utiliza un medio con glucosa y lactosa distribuido por todo el tubo, sin embargo la lactosa está en una concentración 10 veces más que la glucosa.__3º- Si no disponen de suficiente hidratos de carbono (o ya los han metabolizado) recurren a las proteínas produciendo liberación de aminas y alcalinizando el medio de cultivo.

TÉCNICA:__

1- Se recoge el centro de una colonia de un cultivo puro y joven con el hilo de siembra.__2- Se inocula un tubo de cultivo con medio Kliger en pico de flauta por picadura y estrías.__3- Se incuba 37ºC durante 18-24 h. No efectuar la lectura ni antes ni después de ese intervalo. Si se leyera antes puede que no se haya producido la suficiente fermentación de azúcares para formarse un medio ácido capaz de hacer virar el indicador del medio. Si se leyera después de las 24h podría dar un resultado falso alcalino pues el microorganismo podría utilizar la peptona.

RESULTADOS:

1- A) Metabolizan la glucosa: superficie roja y fondo amarillo.B) Metabolizan glucosa y lactosa: superficie y fondo amarillo. C) Utilizan las peptonas: superficie y fondo rojo.D) No metabolizan ni glucosa, ni lactosa, ni peptonas: el medio sigue de color naranja.

2-Producción de gas: se puede detectar por: -formación de burbujas -agrietamiento.-desplazamiento del medio del fondo del tubo.

3- Producción de SH2: se detecta por color negro en parte o en todo el tubo.

INTERPRETACIÓN:

1-BACILOS NO FERMENTADORES DE LA GLUCOSA NI LACTOSA:

Al no fermentar ninguno de estos dos azúcares la bacteria utilizará las proteínas, produciendo una alcalinizacón del medio, cambiando este a color rojo, pero solo en superficie, ya que este proceso ocurre en aerobiosis-

2-FERMENTA LA GLUCOSA PERO NO LA LACTOSA

La bacteria fermentará la glucosa en las primeras horas (el tubo virará todo a amarillo), pero al estar esta en baja proporción pronto se gastarán y tendrán que recurrir a las proteínas de la superficie, transformando esta en un color rojo, quedando el fondo amarillo.3-FERMENTA LA GLUCOSA Y LA LACTOSA:

Al utilizar los dos azúcares se produce una acidificación completa y permanente del tubo, virando este a color amarillo
.

4- Producción de gas

Se puede detectar por: – formación de burbujas :__agrietamiento.__desplazamiento del medio del fondo del tubo.

5- Producción de SH2:

se detecta por: color negro en parte o en todo el tuboPrueba de agar hierro de Kligler:

–
Capacidad de un m.O. De utilizar la glucosa(fam.+) o lactosa->+ , – .-producción de gas y sulfhídrico..-.-Tubos inclinados. Lactosa sin exceso en el medio.

—se realiza 2 siembras:

x estrías en superficie y x picadura.–se hace toda con el hilo de platino,cogiendo solo una vez m.O.–lo ponemos a incubar,obligatoriamente leer a las 18-24h.(si los m.O. Fermentan la glucosa(en defecto) generan ácidos,si se acaba la glucosa,se metabolizan proteínas(básicas)x loq vuelve a rojo el medio,las proteínas,se metabolizan,en superficie x lo solo se vuelve rojo la zona del inclinado.

Posibles resultados(observar 1º crecimiento)(color inicial rojo)

__Tubo todo rojo:las 4 pruebas son – neg.(no enterobacterias)

__Tubo parte abajo amarillo,parte inclinada rojo. :

glucosa+ lactosa–

__Tubo todo amarillo:

lactosa+,glucosa+,(el m.O fermenta la lactosa y la glucosa.

1º tubo ?

KK– (1º dato-si fermenta la glucosa(k=negativo) 2º dato,si fermenta la lactosa K=neg) 3º y 4º dato o – ,OO , o nada

.2º tubo ?

AA–,AA00, AA ( fermenta lactosa y glucosa,gas neg y sulfhídrico neg.)todo el medio es ácido.

3º tubo ?

AK– ,AK00,AK,KA.
(parte medio rojo,parte amarilla.Fermenta la glucosa.).

Tubo raro con movimiento

AA+0 ,AA+-,AA+.-.-.-.Si aparece una burbuja dentro del medio ya es +.

Tubo negro:

KA-+.KA-Sh2.

Observación del gas:

+->por desprendimiento del medio x desquebramiento del medio.Aparición de burbujas
.-
->medio intacto.

Observación del sulfhídrico:

+->medio negro parte o todo
.Hábitat:__agua,tierras,plantas,tracto g.I. Hmbre y animales.__presencia en aguas->cont. Fecal.Son colonicadores normales del tracto intestinal.Clasificacionn. G.Patógenos gstrointestinales para el hombre:eschericia,salmonella,yersinia.G.Patógenos estruintestinales y oportunistas:especies de yersinia,klebsiella.