Estudio de la Morfología en Células Vivas

Objetivo: Observar las células sin producirles la muerte.

Dificultades:

• Se han de estudiar células aisladas.
• Deben estar en un medio de cultivo.
• Generalmente son transparentes.

Microscopios de Observación: Aquellos que aumentan el contraste: campo oscuro, contraste de fase, contraste diferencial – interferencial.

Técnica muy usada para ver cultivos celulares: Tinción vital.

Tinción Vital: Tinción que usa colorantes que se fijan a los componentes celulares sin matar a la célula de forma inmediata. Mejora el contraste y por tanto la observación de células vivas. Los colorantes usados se denominan vitales.

Colorantes Vitales:

• Rojo neutro
• Azul de metileno
• Azul cresil
• Verde Janus

Estudio de la Morfología en Células Muertas

Forma habitual de observación de las células y tejidos. Hay que procesar adecuadamente la muestra para obtener una buena observación.

Procesamiento de la Muestra

• Fijación
• Sección
• Tinción

Fijación

Objetivo: Evitar el rápido deterioro de las células y conservar la morfología y composición química de las células tras su muerte. Además produce endurecimiento de la muestra sólida y adherencia al porta en la líquida.

Tipos:

• Fijadores químicos
• Fijadores físicos

Fijadores Físicos: Actúan por métodos físicos.

Tipos:

• Desecación
• Congelación

Fijadores Químicos: Actúan desnaturalizando, estabilizando y bloqueando a las proteínas en su posición natural.

Clasificación:

• Fijadores simples: Etanol, formol, etc.
• Mezclas fijadoras: Soluciones de Carnoy o Bouin, mezcla de metanol – formol.

Sección de la Muestra

Para observar una muestra al microscopio esta debe ser atravesada por la luz o por el haz de electrones. La sección permite obtener muestras lo suficientemente finas como para ser atravesadas por la luz o por el haz de electrones. En M.O. la muestra debe tener entre 1 y 10µ de espesor.

Sección de Muestras Sólidas

Antes de cortarlas se endurecen por inclusión en un medio de soporte:

• Parafina en M.O.
• Resinas epoxi en M.E.

Los cortes se realizan con:

• Microtomo en M.O.
• Ultramicrotomo en M.E.

Sección de Muestras Líquidas

En este caso se extienden por el porta formando una capa fina y homogénea sobre el. Se denominan extensiones o frotis. Sirven para el estudio de:

• Sangre
• Exudados
• Suspensiones celulares
• Cultivos bacteriológicos
• Etc.

Tinción

Dado que las células son casi transparentes es necesaria para una buena observación de sus estructuras. La tinción se realiza con unas sustancias químicas que son los colorantes. Los colorantes se fijan selectivamente a las estructuras celulares según su afinidad química.

Métodos de Estudio de la Composición Química Celular

• Técnicas citoquímicas
• Técnicas inmunológicas
• Técnicas con radioisótopos
• Técnicas de biología molecular
• Separación de los orgánulos celulares

Técnicas Citoquímicas

Determinan la existencia y localización de los diferentes componentes químicos de las células. Ponen de manifiesto los compuestos analizados mediante la visualización de las sustancias coloreadas resultantes de la reacción química producida entre los compuestos que se estudian y los reactivos específicos.

Compuestos Estudiados:

• Principios inmediatos
• Enzimas
• Acido nucleicos
• Compuestos inorgánicos

Compuestos celulares estudiados por técnicas citoquímicas.

Técnicas Inmunológicas

Son aquellas que determinan la presencia de los diferentes constituyentes químicos de la célula valiéndose de la reacción antígeno – anticuerpo (Ag-Ac). Se basan en la especificidad de la reacción Ag-Ac. Permiten detectar cualquier molécula para la cual se disponga de un Ac específico. Para evidenciar la reacción Ag-Ac se usan distintos sistemas marcadores:

• Enzimas: Técnicas inmunoenzimáticas
• Fluorescencia: Inmunofluorescencia
• Aglutinación
• Etc.

Técnicas con Isótopos Radiactivos

Marca las moléculas biológicas con isótopos radiactivos. El marcaje permite seguir a la célula o molécula marcada durante las reacciones biológicas.

Técnicas de Biología Molecular

Estudian las moléculas biológicas como el ADN, ARN, proteínas… Las técnica mas usuales son:

• Reacción en cadena de la polimerasa o PCR
• Southern blot
• Northern blot

Separación de Orgánulos Celulares

Se realiza mediante la ultracentrifugación de 5.000 a 100.000 r.p.m. previa rotura de las células. Pasos a seguir de menor a mayor velocidad:

• Sedimentan células enteras y núcleos. El sobrenadante se ultracentrifuga y sedimentan mitocondrias y lisosomas. Se vuelve a ultracentrifugar el sobrenadante y precipitan los microsomas. Tras el último ultracentrifugado se separan los ribosomas y las macromoléculas.

Cultivos Celulares

La mayoría de los tipos celulares pueden vivir, reproducirse y expresar propiedades diferenciales en un medio de cultivo. El medio de cultivo debe reunir las características apropiadas de concentración de nutrientes, Ph, humedad, etc.

Tipos de Cultivos

• Cultivo mixto: Aquel que tiene mas de un tipo de células. Permite estudiar las interacciones entre ambas.
• Cultivo primario: En el las células provienen directamente de un organismo.
• Cultivo secundario: En el las células proceden de otro cultivo.

Conceptos Relacionados con los Cultivos Celulares

• Línea celular: Células de un cultivo que han sufrido una modificación genética que las capacita para dividirse infinitamente.
• Clon celular: Línea o colonia celular que procede de la proliferación de una única célula original.
• Clonaje celular: Técnica de obtención de clones celulares.
• Células híbridas: Células obtenida de la fusión de dos células diferentes.
• Heterocarionte: Núcleo fusionado de una célula híbrida que tiene varias dotaciones cromosómicas procedentes de las células originales.
• Hibridoma: Clon celular obtenido a partir de una célula híbrida obtenida por fusión de una célula normal y otra tumoral.

Extensiones Sanguíneas

Es una fina película de sangre extendida sobre un porta. En ella las células se disponen en una sola capa.

Técnicas:

• Manual: Técnica de los dos portaobjetos
• Automática

Técnica de los Dos Portaobjetos

Procedimiento de elección. Consiste en extender una gota de sangre sobre un porta mediante el canto esmerilado de otro. El borde esmerilado del porta extensor se desliza sobre el otro arrastrando la gota de sangre hasta dejarla totalmente extendida. El porta extensor debe formar un ángulo de 45º con el extendido.

Factores que Afectan a la Extensión

El grosor depende de:

• Tamaño de la gota de sangre
• Ángulo de los dos portas:
  • > de 45º: Aumenta el grosor y la extensión es mas corta
  • < de 45º: Disminuye el grosor y la extensión es mas larga

Hematocrito

Zonas de la Extensión

• Cabeza: Zona inicial. Es la mas gruesa. Los hematíes forman mas de una capa.
• Cuerpo: Los hematíes forman una sola capa sin apenas espacio entre ellos. Proporción equilibrada de células. Mejor zona de observación.
• Cola: Zona final. Las células se disponen de forma acordonada dejando huecos. Termina de forma deshilachada en las denominadas “barbas”.

Distribución Celular

En todas las zonas las células se distribuyen de igual forma:

• Células grandes: Mas abundantes en los bordes.
• Células pequeñas: Mas abundantes en el centro.

Características de una Buena Extensión

• Debe presentar claramente las tres zonas que la componen.
• El paso de una zona a otra debe ser progresivo.
• Debe haber una disminución gradual del grosor de la cabeza a la cola.
• El inicio y final deben estar a 1cm de los extremos del porta.
• Los bordes laterales de la extensión deben estar a 1–2mm de los del porta.

Extensiones Defectuosas

• Gota muy grande: Se llega al final del porta sin formar las “barbas”.
• Levantar el porta antes de acabar la extensión: No se forma la cola.
• Presencia de zonas agujereadas: Hay grasa en el porta por falta de limpieza.
• Los bordes de la extensión coinciden con los del porta: Se ha tardado mucho en deslizar un porta sobre otro.
• Aparición de estrías longitudinales: El borde del porta extensor estaba mal esmerilado.
• Alternancia de zonas gruesas y finas: Extensión en “persiana” debida a una velocidad de deslizamiento no homogénea.

Tinciones Hematológicas

Conjunto de procesos que conducen a la coloración de las distintas estructuras celulares y de esta forma poder distinguirlas al MO.

Colorante tipo Romanowsky: Mezcla formada por un colorante ácido, la eosina, y uno o varios básicos como el azul de metileno y sus derivados los azures A, B y C.

Tinción panóptica: La realizada con un colorante tipo Romanowsky y proporciona una gran gama de colores.

Tipos de Tinciones Hematológicas

Se diferencian en la composición del colorante usado:

• Tinción de Giemsa
• Tinción de May-Grünwald
• Tinción de May-Grünwald- Giemsa o panóptico de Pappenheim
• Tinción de Wright
• Panóptico rápido

..Las mas usadas son la de May-Grünwald- Giemsa y la de Wright por su calidad ..El panóptico rápido se usa en el laboratorio de urgencias por la rapidez de realización.

Técnica de Tinción

Hay dos técnicas básicas:

• Inundación – decantación: Los reactivos se echan sobre la preparación que está en posición horizontal y se eliminan decantando.
• Inmersión: Las extensiones se sumergen en recipientes que contienen los reactivos.

La calidad de la tinción depende de:

• Tipo y características del colorante.
• Método de tinción empleado.
• Color de las estructuras celulares.

Estructura	Color
Hematíes	Rosado
Plaquetas	Violeta claro
Núcleo	Violeta oscuro
Citoplasma basófilo	Azul
Citoplasma acidófilo	Rosado
Gránulos neutros	Marrónáceo o pardo
Gránulos eosinófilos	Marrónáceo o pardo
Gránulos basófilos	Violeta oscuro
Gránulos azurófilos	Púrpura