Fundamentos de Espectrofotometría y Técnicas Analíticas

Componentes Clave del Espectrofotómetro

Detector: Se basa en el efecto fotoeléctrico, donde los fotones inciden sobre un material, liberando electrones que generan una corriente eléctrica proporcional a los fotones recibidos. Esta señal eléctrica mínima se amplifica posteriormente.

Monocromador: Dispositivo óptico que selecciona y transmite una radiación monocromática a partir de la luz generada por la fuente emisora. La luz atraviesa una rendija de entrada, llega al selector de longitud de onda y sale por una rendija de salida como un rayo organizado de luz paralela con la longitud de onda deseada.

Métodos de Medición en Espectrofotometría

Medición de Punto Final: Aplicable a moléculas poco absorbentes o no absorbentes en longitudes de onda UV-VIS mediante métodos indirectos. Estos métodos implican la reacción de las moléculas con otros compuestos para formar derivados absorbentes. Los métodos que utilizan enzimas como reactivos se conocen como métodos enzimáticos. La concentración del analito es directamente proporcional a la concentración de uno de los productos formados en la reacción. En condiciones establecidas, se cumple la ley de Lambert-Beer, y se emplea un factor de calibración para calcular la concentración.

• Punto Final en Reacciones Colorimétricas: La técnica colorimétrica determina la concentración de una sustancia o el producto de su reacción con un reactivo específico. La absorbancia del producto es proporcional a la concentración del analito.
• Punto Final en Reacciones Enzimáticas: Se acopla una reacción enzimática donde la sustancia problema es el sustrato de una enzima específica. Esta enzima transforma la sustancia en un producto coloreado que absorbe en el UV-visible, permitiendo su lectura en el espectrofotómetro.

Concentración en Técnicas Cinéticas: Se mide la velocidad de la reacción antes de su conclusión. La variación de la absorbancia por unidad de tiempo es proporcional a la concentración y/o actividad del analito. A mayor concentración del parámetro biológico, mayor será la variación de absorbancia en la unidad de tiempo.

• Cinéticas en Reacciones Enzimáticas: La enzima añadida, como parte de los reactivos, al unirse al parámetro, desencadena una reacción que permite su determinación por la variación de la absorbancia por unidad de tiempo. Es una técnica cinética, y el incremento de absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de glucosa en la muestra.

Cálculo de la Actividad Enzimática

La concentración de enzimas en suero es muy baja. Sin embargo, dada su elevada capacidad catalítica, es posible determinar su actividad y presuponer que dicha capacidad es proporcional a su concentración. El cálculo se realiza midiendo la velocidad de reacción, es decir, la cantidad de sustrato que desaparece o la cantidad de producto que se forma en un intervalo de tiempo. Las reacciones enzimáticas son muy sensibles a las condiciones de reacción, por lo que se debe controlar estrictamente la temperatura, el pH y las concentraciones de reactivos.

• Punto Final: Se ponen en contacto reactivo y muestra (enzima) y se determina la absorbancia a la longitud de onda indicada. Tras un tiempo establecido, se detiene la reacción (desnaturalización de la enzima) y se mide la absorbancia final.
• Cinéticos: Estos métodos son superiores porque permiten detectar desvíos de la linealidad y asegurar que la velocidad constante se mantiene durante el ensayo. La actividad enzimática se expresa en unidades de actividad enzimática (U), que es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol de sustrato por minuto. La concentración catalítica se expresa como U/L. En el Sistema Internacional de Unidades (SI), se utiliza el katal para transformar un mol de sustrato en un segundo.

Tipos de Espectrofotometría y sus Aplicaciones

A continuación, se describen diversas técnicas espectrofotométricas y sus aplicaciones:

• Absorción Molecular: Mide la cantidad de luz absorbida por moléculas en una muestra, utilizando los principios de la interacción de la luz con los niveles energéticos de las moléculas. Se utiliza una fuente de luz ultravioleta-visible (UV-Vis) o infrarroja (IR). Aplicación: Análisis cuantitativo de compuestos orgánicos y biomoléculas, como proteínas y ácidos nucleicos.
• Absorción Atómica: Determina la concentración de elementos metálicos midiendo la luz absorbida por átomos libres en estado gaseoso. Se utiliza una lámpara de cátodo hueco o una lámpara de descarga sin electrodos (EDL). Aplicación: Análisis de trazas metálicas en muestras ambientales, biológicas y de alimentos.
• Emisión Molecular: Mide la luz emitida por moléculas excitadas cuando vuelven a su estado basal. Se utiliza una fuente de excitación, como un láser o una lámpara de xenón. Aplicación: Identificación y cuantificación de compuestos fluorescentes, como marcadores en biología molecular.
• Emisión Atómica: Los átomos excitados emiten luz a una longitud de onda específica cuando vuelven a su estado basal. La intensidad de la emisión se relaciona con la concentración del elemento. Se utiliza un plasma acoplado inductivamente (ICP) o una llama para excitar los átomos. Aplicación: Análisis multielemental de metales y no metales en muestras industriales y ambientales.
• Dispersión: Se basa en la dispersión de la luz al pasar por una muestra, lo que permite estudiar su estructura o composición. Se utiliza una lámpara de xenón o halógena. Aplicación: Determinación de tamaños de partículas o estudios de propiedades ópticas de materiales.
• Refractometría: Mide el cambio en la dirección de la luz al pasar de un medio a otro, relacionado con el índice de refracción de la muestra. Se utiliza una fuente de luz blanca o LED. Aplicación: Análisis de la concentración de solutos en soluciones, como azúcar o sal en alimentos.
• Reflectancia: Mide la cantidad de luz reflejada por una superficie en función de la longitud de onda. Se utiliza una fuente de luz blanca o UV-Vis. Aplicación: Caracterización de superficies, estudios de películas delgadas y materiales ópticos.
• Turbidimetría: Mide la reducción de la intensidad de luz cuando pasa a través de una muestra turbia o con partículas en suspensión. Se utiliza una lámpara de tungsteno o LED. Aplicación: Cuantificación de la concentración de partículas en suspensión en líquidos, como en análisis de agua o bebidas.
• Nefelometría: Mide la luz dispersada por partículas en una muestra, en lugar de la luz absorbida o transmitida. Se utiliza una lámpara de tungsteno o láser. Aplicación: Detección de proteínas en suero o análisis de turbidez en muestras biológicas.

Principios de Cromatografía

Tipos de Cromatografía según la Fase Móvil y la Fase Estacionaria

• Fase Móvil (FM) Líquida y Fase Estacionaria (FE) Sólida: Adsorción, intercambio iónico, afinidad y exclusión.
• FM Líquida y FE Líquida: Reparto.
• FM Gas y FE Sólida: Adsorción.
• FM Gas y FE Líquida: Reparto.

Conceptos Clave en el Control de Calidad

• Control: Muestra con composición química conocida y estable utilizada para verificar la precisión y exactitud de los ensayos de laboratorio. Los controles detectan errores sistemáticos o aleatorios, asegurando resultados confiables.
• Patrón: Sustancia pura y de concentración conocida utilizada como referencia en análisis cuantitativos. Los patrones establecen la relación entre la concentración de un analito y la respuesta del instrumento, a menudo mediante una curva de calibración.
• Calibrador: Solución o material de referencia con una concentración específica y conocida de uno o más analitos, utilizada para ajustar y calibrar los instrumentos de medición. Asegura que las mediciones sean precisas y comparables entre diferentes equipos o laboratorios.
• Blanco: Muestra que contiene todos los reactivos del ensayo excepto el analito a medir. Corrige cualquier interferencia o ruido de fondo, asegurando que la señal detectada provenga únicamente del analito.