Espectrofotometría y Enzimología

Limitaciones de la Ley de Lambert-Beer

• Variaciones en la absortividad a altas concentraciones (>0.01M) debido a interacciones electrostáticas de moléculas muy cercanas entre sí.
• Dispersión de la luz debido a la presencia de material particulado en la muestra.
• Fluorescencia o fosforescencia de la muestra.
• Cambios en el equilibrio químico dependientes de la concentración.

Esta curva de calibración es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco soluciones de concentraciones conocidas (estándar), con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda de trabajo.

Un espectrofotómetro es un equipo que nos permite hacer mediciones a una longitud de onda (λ) fija. Además, nos permite hacer barridos, esto es, hacer mediciones a distintas λ en una sola operación y presentar el resultado como un gráfico de la absorbancia versus λ.

Tipos de Filtros en Espectrofotometría

• Filtros de absorción: sirven para la región visible del espectro y funcionan absorbiendo ciertas zonas de este.
• Filtros de interferencia: su funcionamiento se basa en la interferencia óptica, la interferencia destructiva entre la radiación que se quiere eliminar.

Método de Bradford para la Determinación de Proteínas

El método de Bradford se fundamenta en la formación de un complejo entre el azul de coomassie G-250 y las proteínas.

• Ventajas: compatibilidad con agentes reductores utilizados para estabilizar las proteínas en solución.
• Desventajas: incompatibilidad con detergentes.

Tipos de Blancos en Ensayos Enzimáticos

• Blanco de Sustrato: en ella se reemplaza la solución que contiene al sustrato por un volumen equivalente de su solvente. Puede ser reemplazado por agua o el buffer de la reacción.
• Blanco de Enzima: en ella se reemplaza la solución que contiene a la enzima por un volumen equivalente de su solvente.
• Tiempo Cero: consiste en que la reacción es detenida en el momento mismo en que se inicia (tiempo cero). Por lo general, una reacción enzimática se inicia con la adición de la enzima o bien con la de su sustrato. Se determina la cantidad de producto formado por un espectrofotómetro.

Biomoléculas: Glúcidos y Lípidos

Invertasa

Invertasa: según Berthelot. El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos, glucosa y fructosa.

Glucosa

La glucosa se clasifica como monosacárido del tipo polihidroxialdehído de baja masa molecular. Corresponde a una aldohexosa, es decir, está formada por 6 átomos de carbono y un grupo aldehído en el carbono uno. En solución acuosa, el grupo carbonilo y los grupos hidroxilo de la glucosa reaccionan intramolecularmente para formar una estructura cíclica de 5 miembros denominada piranosa.

Forman parte de los tejidos de sostén de plantas y animales y es una fuente de energía importante.

Glucógeno

Reserva de glucógeno en animales: hígado (mantiene el nivel de glucosa en la sangre) y músculos esquelético (abastece de energía en la contracción muscular).

Enzimas Implicadas en el Metabolismo del Glucógeno

• Glucógeno Fosforilasa: cataliza la escisión fosforolítica de los enlaces glicosídicos α (1,4), que consiste en la separación secuencial de restos de glucosa desde el extremo no reductor, según la siguiente reacción:
• Enzima Desramificante del Glucógeno: degrada los enlaces glicosídicos α(1-6).
• Fosfoglucomutasa: se encarga de transformar la Glucosa-1-P en Glucosa-6-P. Esta es una reacción reversible.

Regulación Hormonal del Metabolismo del Glucógeno

• En condiciones de hipoglicemia, el glucagón producido por el páncreas activa la acción de la glucógeno fosforilasa, estimulando la degradación del glucógeno en el hígado, liberando glucosa al torrente sanguíneo con lo que su concentración aumenta.
• En condiciones de hiperglicemia, la insulina producida también en el páncreas activa la acción de la glucógeno sintetasa que estimula la síntesis de glucógeno, por lo que la concentración de glucosa libre en la sangre disminuye.

Lípidos

Los lípidos simples más importantes son el colesterol y los ácidos grasos; dentro de los lípidos complejos se pueden mencionar los fosfolípidos y los triglicéridos. El colesterol es una grasa presente en todas las células del organismo. Se presenta en altas concentraciones en la médula espinal, páncreas y cerebro, pero se sintetiza principalmente en el hígado y en el intestino delgado.

Vías de Obtención y Síntesis del Colesterol

• Vía exógena o absorción de colesterol contenido en los alimentos.
• Vía endógena o síntesis de colesterol en las células animales a partir de su precursor, el acetato, en su forma activada acetil-coenzima A.

Funciones del Colesterol

• Estructural: es un componente muy importante de las membranas plasmáticas de los animales.
• Precursor de la vitamina D: esencial en el metabolismo del calcio.
• Precursor de hormonas sexuales: progesterona, estrógenos y testosterona.
• Precursor de las sales biliares: esenciales en la absorción de algunos nutrientes lipídicos y vía principal para la excreción de colesterol corporal.

Tipos de Lipoproteínas y Riesgo Cardiovascular

• LDL: compuestas principalmente por colesterol y una proteína llamada apoB. Es la forma en que el organismo recoge el colesterol del hígado (donde lo sintetiza) y lo distribuye a los tejidos. Se considera el «colesterol malo», responsable de la aterosclerosis, o acumulación del colesterol en la pared de las arterias.
• HDL: compuestas principalmente por colesterol y una proteína llamada apoA. Se considera el «colesterol bueno», porque transportan el exceso de colesterol desde los tejidos hasta el hígado.

Niveles de Colesterolemia y Riesgo Cardiovascular

• Colesterolemia por debajo de 200 mg/dL: es la concentración deseable para la población general, bajo riesgo de enfermedad cardiovascular.
• Colesterolemia entre 200 y 239 mg/dL: existe un riesgo intermedio en la población general, pero es elevado en personas con otros factores de riesgo como diabetes.
• Colesterolemia mayor de 240 mg/dL: puede determinar un alto riesgo cardiovascular.

Aterosclerosis

Aterosclerosis: consiste en el depósito de células cargadas de partículas de LDL-colesterol en las paredes de las arterias. Esta pared responde a la agresión induciendo una respuesta protectora, que conduce a la formación de una placa. Con el paso del tiempo, la placa aumenta de tamaño, hasta que estrecha la arteria dificultando la circulación de la sangre. Por otra parte, la placa también se puede romper, originando un trombo que puede obstruir completamente la arteria. El final del proceso es que el corazón se ve privado de oxígeno y nutrientes, por lo que se produce una angina o infarto de miocardio.