Medios de Cultivo

El cultivo, en algunos casos, se realiza en agar sólido o en caldo, especialmente para especies como Leishmania, Trichomonas, Giardia, Entamoeba, T. gondii y Plasmodium. Este método se utiliza para estudiar en profundidad los mecanismos de infección, adaptación, sensibilidad a tratamientos, etc. El medio clásico para hemoflagelados es el NNN (Novy, Neal, Nicolle).

Diagnóstico de T. vaginalis

Orina

Los trofozoitos móviles de T. vaginalis pueden encontrarse en la orina de pacientes masculinos. Para su investigación, se centrifuga la muestra y el sedimento se mezcla con 1 o 2 gotas de solución salina. Luego, se cubre con un cubreobjetos y se observa. Se puede utilizar tinción con yodo.

Hisopos

Se realizan extensiones en fresco a partir de hisopos o raspados vaginales. Si la muestra no puede ser examinada inmediatamente, debe conservarse en PVA (alcohol polivinílico).

Diagnóstico de Protozoos Intestinales

Tipos de Muestras de Heces

Las muestras deben recogerse en recipientes limpios, secos y herméticos. Hay que asegurarse de que no se recoge orina u otro componente ajeno a las heces.

1. Distribución de fases según la consistencia: en heces diarreicas encontramos trofozoítos, en las formes quísticas.
2. Las heces frescas deben examinarse inmediatamente o conservarse en frío.
3. Asegurar que el recipiente esté bien cerrado.
4. Algunos medicamentos y compuestos afectan a los parásitos, haciendo que las muestras dejen de ser adecuadas para un examen.
5. Es necesaria la obtención de otras muestras de heces si la primera resulta negativa. Se obtendrán 3 muestras con un intervalo de 2-3 días.

Conservación de Muestras

Métodos más comunes:

Formalina al 10%

• Ventajas: fácil de preparar, larga vida útil, buena conservación de huevos de gusanos, larvas, quistes y ooquistes. Adecuado para realizar técnicas de concentración y microscopía de fluorescencia. Compatible con kits de inmunoensayo. Apto para tinciones: ácido-rápida, safranina y cromotropo.
• Inconvenientes: no adecuado para algunas tinciones permanentes, no adecuado para conservar la morfología de trofozoítos de protozoos, puede interferir con PCR.

PVA (Alcohol Polivinílico)

• Ventajas: conserva bien la morfología de trofozoitos y quistes. Preparación fácil de extensiones con tinciones permanentes. Las muestras conservadas en PVA son estables durante varios meses.
• Inconvenientes: no adecuado para conservar la morfología de huevos y larvas, contiene mercurio (difícil de tratar y eliminar), difícil de preparar, no adecuado para técnicas de concentración, no debe usarse en kits, no es adecuado para tinciones rápidas.

Tinciones Más Utilizadas

Examen de las Muestras en Fresco

Permite la observación de trofozoítos móviles de forma inmediata.

• Muestras de heces diarreicas: se observan trofozoitos a la media hora.
• Muestras de consistencia intermedia: se observan quistes y trofozoitos antes de 1 hora.

Procedimiento:

1. Colocar un portaobjetos identificado con los datos del paciente. Poner una gota de solución salina en la parte izquierda y una gota de solución yodada en la derecha.
2. Con una varilla, tomar una pequeña porción de la muestra y mezclarla con la gota de solución salina.
3. Tomar una pequeña cantidad de heces y mezclarla con la gota de solución yodada.
4. Cubrir ambas gotas con un cubreobjetos.

Técnicas de Concentración

Sirven para separar restos fecales y aumentar la detección de parásitos presentes en poca cantidad. Se dividen en dos grupos: sedimentación (puede utilizar muestras conservadas en formalina, como la técnica MIF) y flotación.

Procedimiento general para una técnica de sedimentación:

1. Añadir formalina a 1g de heces y remover con un palillo hasta obtener una suspensión turbia.
2. Ajustar un filtro de gasa a un embudo y colocarlo sobre un tubo de centrífuga.
3. Pasar la suspensión fecal por el filtro al interior del tubo de centrífuga.
4. Retirar el filtro y desecharlo junto con el residuo sólido.
5. Añadir éter de acetato de etilo y mezclar.
6. Centrifugar.
7. Despegar el tapón graso con un palillo aplicador y desechar el sobrenadante invirtiendo el tubo.
8. Colocar en una gradilla y dejar que el líquido de los lados vuelva al sedimento. Mezclar bien y transferir una gota a un portaobjetos para examinarlo bajo un cubreobjetos.

Tinción Tricrómica

Se realiza añadiendo compuestos secos sobre ácido acético antes de añadir agua. Se preparan extensiones en portaobjetos antes de que se sequen y se añade el fijador de Schaudinn.

Procedimiento de tinción:

1. Introducir el portaobjetos en una cubeta con etanol al 70%.
2. Introducir el portaobjetos en la solución de tricrómico.
3. Introducir el portaobjetos en la solución decolorante de ácido acético.
4. Lavar en etanol al 90%.
5. Introducir una vez en etanol al 95%.
6. Introducir una segunda vez en etanol al 95%.
7. Introducir en etanol puro.
8. Dejar el portaobjetos en xileno.
9. Retirar el portaobjetos (no dejar secar).
10. Poner líquido de montaje y cubrir con un cubreobjetos.

¿Qué se observa?

• El citoplasma del parásito se tiñe de color azul verdoso a violeta.
• La cromatina nuclear, los cuerpos cromáticos y otros orgánulos se tiñen de rojo a violáceo.
• El fondo de la preparación, así como las levaduras, se tiñen de color verde.
• Los ooquistes de Cryptosporidium son difíciles de reconocer con esta tinción.
• Los glóbulos blancos, macrófagos y otros elementos pueden ser un problema para el diagnóstico.

Tinción Ácido-Rápido Modificada

Se utiliza para la identificación de ooquistes de especies de Cryptosporidium. La tinción suele realizarse sobre el sedimento obtenido de la técnica de concentración a partir de una muestra fresca.

Procedimiento:

1. Preparar una extensión a partir de 1 o 2 gotas de la muestra en un portaobjetos y dejar secar.
2. Fijar con metanol absoluto.
3. Teñir con fucsina fenicada (carbol fucsina).
4. Decolorar con ácido-alcohol.
5. Lavar con agua destilada.
6. Contrateñir con azul de metileno.
7. Lavar con agua destilada.
8. Dejar secar al aire y observar con aceite de inmersión.

¿Qué se observa?

• Los ooquistes de Cryptosporidium se tiñen de color rosado brillante a fucsia y se distinguen del fondo azul claro.
• Las células de hongos se tiñen de color azul verdoso.