QUÍMICA SECA

La química seca se refiere a la presentación de los reactivos que se encuentran embebidos en una matriz en estado seco y no precisa rehidratación antes de su utilización. Los reactivos se sumergen directamente en la muestra objeto de estudio y esta actúa como solvente. Los sistemas de reactivos en química seca comprenden:

• Los sistemas de tiras reactivas: formados por unas tiras de plástico que sirven de soporte a los reactivos que se encuentran en el interior de una matriz (celulosa).
• Sistemas de películas multicapa: presentan los reactivos como finas láminas superpuestas.

La lectura de resultados puede ser:

• Visual: cualitativa o semicuantitativa.
• Fotometría de reflexión: cuantitativa.

La química seca se utiliza para facilitar el diagnóstico rápido en UCIs, quirófanos, paritorios, también en screening de orinas, en el control de diabetes, etc.

Ventajas de la Química Seca

• Facilidad de uso. Ej. control de glucemia en diabéticos.
• No es necesaria la preparación previa de los reactivos -> disminuimos manipulaciones que pueden producir errores en el resultado.
• Reactivos estables mucho tiempo y su almacenamiento es fácil.

Inconvenientes de la Química Seca

• Su elevado precio frente a la espectrofotometría de absorción.

FUNDAMENTO

Cuando un haz de luz incide sobre una superficie, este es reflejado originando dos tipos de reflexión:

• Una reflexión especular: el haz de luz es reflejado con un ángulo de reflexión igual al de incidencia (como por un espejo).
• Una reflexión difusa o reflactancia, debida a fenómenos de absorción y dispersión producidos por los distintos componentes de las capas que atraviesa el haz de luz. Obtenemos un haz de luz que sale de la fase sólida con una intensidad que podemos medir.

Reflactancia (R)

Relación entre la intensidad de luz reflejada y la intensidad de luz incidente. R=Ir/Io.

Para facilitar los cálculos, es necesario linealizar esta relación -> conseguir una relación lineal entre la concentración y la medida de reflactancia.

Para establecer una relación lineal entre ambos parámetros, concentración y reflactancia, se recurre a las ecuaciones de Kubelka-Munk y la de Williams-Clapper. El empleo de una u otra ecuación depende de la iluminación, características de reflactancia del reactivo seco y la disposición de los elementos en el instrumento de medida.

ESPECTROFOTÓMETROS DE REFLACTANCIA

La medida de la reflactancia producida después de la incidencia de luz sobre la muestra situada en el reactivo en fase sólida se realiza, bien mediante la comparación visual del color obtenido con una escala de colores o mediante la utilización de un sofisticado equipo, los espectrofotómetros de reflactancia los cuales miden la reflactancia y la relacionan con la concentración de la sustancia. El funcionamiento de los espectrofotómetros de reflactancia es similar a los espectrofotómetros de absorción pero su diseño es más complejo.

Componentes de un espectrofotómetro de reflectancia:

1. Fuente de luz.
2. Sistemas ópticos.
3. Reactivos en fase sólida:
   • Tiras reactivas.
   • Películas multicapa o «slides».
4. Detector y sistemas de lectura.

1.- Fuente de luz:

Se emplean fundamentalmente 2 tipos de lámparas:

• Lámparas de espectro continuo de haluro de tungsteno.
• Lámparas de espectro discontinuo como el arco de xenón o un LED.

2.- Sistemas ópticos:

Combinaciones de lentes, espejos y filtros o sistemas integrados en forma de esfera cuyo fin es dirigir el haz de luz reflejada al detector para su lectura.

3.- Reactivos en fase sólida:

La muestra se sitúa en los reactivos de fase sólida, bien tiras reactivas o reactivos multicapa. Todos los componentes necesarios para que se produzca la reacción están impregnados en ellos, y es donde tiene lugar la reacción y la lectura.

La muestra, que contiene el analito a determinar, se aplica sobre la superficie del reactivo en fase sólida y, a partir de esta, difunde a la matriz disolviendo los componentes que contiene y produciéndose la reacción.

Los componentes básicos son tres:

• Parte soporte: lámina de material plástico que sirve de soporte y recubierta de materiales reflectantes que la convierten en capa reflectora.
• Parte reflectante: función: reflejar la luz; característica principal: absorbancia de luz a la longitud de onda de trabajo sea nula para asegurar máxima sensibilidad.
• Parte reactiva: contiene en forma deshidratada, los reactivos y sustancias auxiliares para que se produzca la reacción. En ocasiones, debido a la complejidad de algunas reacciones y a la incompatibilidad de los reactivos, estos se disponen en forma de capas e incluso se interponen otras capas para separar metabolitos que interfieren en la reacción.

Opcionalmente se pueden añadir otras partes complementarias como:

• Capa difusora: función: hacer que la muestra difunda rápidamente hacia los laterales tras su aplicación, consiguiéndose así una distribución uniforme del volumen de muestra por unidad de volumen de reactivo. De membranas o de papel.
• Capa separadora de plasma: en los sistemas para analizar sangre total, su función es retener las células y permitir el paso del plasma hacia la matriz del reactivo. Suele ser de fibra de vidrio.

Tiras reactivas:

Lámina de plástico blanca rígida que sirve de soporte a una matriz constituida por fibras como la celulosa impregnada con los reactivos. Si la tira está diseñada para determinar distintos componentes de la muestra -> a cada analito le corresponde una zona reactiva diferente. La lectura del resultado se realiza sobre la superficie sobre la que se deposita la muestra.

Películas multicapa o «slides»:

Constituidas por diferentes capas, muy finas, a través de las cuales se van produciendo de forma secuencial todas las etapas que llevan a la determinación cuantitativa del analito.

Tienen apariencia de una diapositiva y están constituidas por 4 capas de naturaleza gelatinosa que llevan incluidos todos los componentes del sistema y se encuentran enmarcadas en un soporte de poliéster. La lectura se realiza por el reverso de la superficie. El sistema de más amplia implantación es el Eklachem de Kodak.

4.- Detector y sistemas de lectura:

La lectura de la reflactancia se puede hacer básicamente por dos procedimientos:

• Lectura sobre la superficie: La muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reacción; el color resultante se determina midiendo la reflactancia sobre la superficie. Se utiliza en las tiras reactivas.
• Lectura por el reverso de la superficie: La muestra se aplica sobre la superficie del reactivo, difunde y se produce la reacción; la reflactancia se mide sobre el lado opuesto a la superficie. Se utiliza en los sistemas multicapas o slides.

CENTRIFUGACIÓN

Un sólido sedimenta o flota dependiendo de su densidad respecto a la del líquido; el sólido experimenta una fuerza ascendente debida al empuje que el líquido ejerce sobre éste, cuya magnitud es igual a la del peso del líquido desplazado por el sólido (principio de Arquímedes). El sólido sedimentará si esta fuerza es inferior a la fuerza que la gravedad ejerce sobre el sólido; en caso contrario, flotará. Si las partículas son muy pequeñas, los procesos de sedimentación o flotación pueden ser extremadamente lentos por la resistencia al avance de las partículas provocada por la fricción que se establece entre éstas y las del líquido, y por los movimientos aleatorios de las partículas inducidos por las turbulencias térmicas que se generan en el seno del líquido (difusión). En estos casos, hay que recurrir a la centrifugación para separarlas.

Centrifugación

Técnica de separación que se utiliza para aislar o concentrar partículas suspendidas en un líquido aprovechando la diferente velocidad de desplazamiento según su forma, tamaño o peso al ser sometidas a una fuerza centrífuga.

Fuerza centrífuga

La fuerza que se ejerce sobre un cuerpo cuando éste gira alrededor de un eje. Es una fuerza cuya magnitud es directamente proporcional a la masa del cuerpo, el radio de giro y la velocidad de giro, es perpendicular al eje y tiende a alejar el cuerpo del mismo. Puede acelerar el proceso de sedimentación de partículas que tienen tendencia a hacerlo espontáneamente o provocar este proceso en aquellas que tienden a flotar.

Instrumental

Tubos

Hechos de materiales inertes que no interaccionan con los componentes de la muestra y resistentes a la deformación a altas velocidades. La elección depende del tipo de rotor, muestra, volumen y tipo de fraccionamiento. Pueden ser de vidrio o de materiales poliméricos.

Centrífugas

Hay diferentes tipos de centrífugas según el rango de velocidades de giro:

A. De baja velocidad, sobremesa o clínicas

De pequeño tamaño y sin refrigeración. Velocidad máxima 5000 rpm. Útiles para la separación de partículas grandes como células o precipitados de sales insolubles. No tienen sistemas auxiliares. Incorporan una tapa de seguridad que imposibilita su apertura hasta que la centrífuga se ha detenido completamente.

Centrífugas micrófugas

Variante de las centrífugas de baja velocidad, permiten llegar a velocidades de más de 10.000 rpm, siendo los volúmenes de trabajo muy pequeños. Son útiles en el campo de la biología molecular. Otra variante son las centrífugas de hematocrito.

B. De alta velocidad

Velocidad entre 18.000 y 25.000 rpm. Son refrigeradas y algunas tienen sistema de vacío para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Son útiles en la separación de fracciones celulares, pero insuficientes para la separación de ribosomas, virus o macromoléculas en general.

C. Ultracentrífugas

Superan las 50.000 rpm, tienen sistemas auxiliares de refrigeración y de alto vacío. Hay ultracentrífugas analíticas que permiten la obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación y preparativas, útiles para aislar partículas de bajo coeficiente de sedimentación.

Rotor

Pieza que gira impulsada por el motor y sobre la cual se coloca la muestra. Han de ser de materiales ligeros y resistentes a altas velocidades de giro. Los mejores son de titanio y fibra de carbono ya que son ligeros y resistentes.

Tipos de rotores

1. Oscilantes, flotantes o basculantes

El adaptador del tubo está unido al brazo del rotor por su parte superior, pero no está fijo a él. Durante la centrifugación, los tubos pierden la verticalidad a causa de la fuerza centrífuga y se sitúan perpendiculares al eje de rotación. Se utilizan para separaciones más precisas ya que la fuerza centrífuga se ejerce en la dirección de la longitud del tubo. Se pueden separar partículas esencialmente en función de su densidad utilizando gradientes de densidad en un disolvente (isopícnicos).

2. De ángulo fijo

El adaptador del tubo tiene una cierta inclinación respecto al eje de giro. Se utilizan para las separaciones más simples (células, membranas) sobre todo en separaciones secuenciales a velocidades de rotación crecientes.

3. Verticales

Rotores macizos con compartimentos esculpidos paralelos al eje.

Modalidades

Según el propósito

Centrifugación analítica

Objetivo: medir las propiedades físicas de las partículas que sedimentan, tales como coeficiente de sedimentación o su masa molecular. Especialmente la variante ultracentrifugación analítica. Las moléculas se observan mediante un sistema óptico durante la centrifugación. Los tubos de centrífuga deben ser de cuarzo para dejar pasar la luz visible y ultravioleta. Se utiliza un rotor basculante para la observación en horizontal.

Centrifugación preparativa

Objetivo: aislar partículas, células o moléculas para su análisis o utilización posterior.

Según el medio en el que se centrifuga y la forma con que se aplica la muestra

Centrifugación diferencial

Método más común de separación, y es rara la purificación enzimática que no lo utiliza. El tubo de centrífuga se llena con una mezcla uniforme del problema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. Es un método bastante inespecífico, y no se puede saber si la partícula buscada quedará en el sobrenadante, en el pellet o repartido entre ambos.

El comportamiento de cada componente de la muestra depende de su forma, tamaño, densidad y de las condiciones de centrifugación. Es una técnica muy útil, sobre todo para aislamiento de células y orgánulos subcelulares.

Centrifugación mediante un gradiente de densidades

Proceso mediante el cual las partículas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido. Tiene ventajas que compensan el trabajo añadido. La técnica permite la separación de varios o todos los componentes de la muestra y la realización de medidas analíticas. Implica la utilización de un soporte fluido cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior.

El gradiente

Se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular, de tal manera que la muestra a analizar pueda ser suspendida en la solución resultante. Como solutos se utilizan la sacarosa, polisacáridos sintéticos… La muestra se deposita en la parte superior del gradiente como una fina banda y, tras centrifugar, la separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas que pueden ser separadas (o fraccionadas).

Gradiente continuo

Pueden ser hechos a partir de gradientes discontinuos -> los límites entre las capas comienzan a desaparecer en la medida que los solutos difunden, así las discontinuidades comienzan a linealizarse y en un tiempo suficiente la densidad se volverá completamente uniforme. Se hace rotando cuidadosamente el tubo de una posición vertical a una horizontal, bajo estas condiciones un gradiente discontinuo se convierte en continuo en menos de 1 hora.

Gradiente discontinuo

El método más utilizado es empezar con la solución más densa y colocarlas en capas de menor densidad sucesivamente, evitando efectos de mezcla y oclusión de aire.

Centrifugación zonal

:la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidades previamente formado.A causa de la fuerza centrífuga las partículas se mueven a velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes zonas del gradiente.La densidad máxima del gradiente no ha de exceder a la de las partículas a separar.Centrifugación isopícnica:separa les partículas en un gradiente de densidades en función de la densidad de las mismas. Las partículas se mueven en el gradiente hasta que llegan a un punto donde la densidad de éstas y la del gradiente son idénticas (de aquí el nombre de isopícnico).En este caso, es condición fundamental que la densidad máxima del gradiente final ha de exceder siempre a la densidad de las partículas.Por este motivo la sedimentación final no se produce si se controlan las condiciones de centrifugación, ya que las partículas flotan sobre un «colchón» de material que posee una densidad superior a la de éstas.Esta técnica se utiliza para separar partículas similares en tamaño pero de diferente densidad. En este sentido,la centrifugación isopícnica es un método adecuado para separar ácidos nucleicos o diferentes orgánulos celulares. Cálculos:Se conseguirá una misma separación en dos centrífugas distintas cuando sea igual su FCR, no si es igual la velocidad de giro. La relación entre ambas depende del radio del rotor. (Medido desde el eje de giro hasta la posición de la muestra).