Tipos de Biorreactores y su Optimización: Diseño, Agitación, Aireación y Esterilización
Tipos de Biorreactores
Biorreactores de Lecho Fijo
Sistema de retención para aumentar la concentración enzimática o celular.
- Inclusión: retención en el interior de una membrana o matriz de alginato o carragenato.
- Adhesión (biofilms): Inoculación progresiva sobre el soporte. EJ.: isomerización enzimática de glucosa, producción de etanol por S. cerevisiae, biofiltros aerobios y anaerobios.
Ventajas
- Proceso inhibido por producto
- Fácil operación y control
- Buen control de la temperatura
- Recirculación de la fase líquida (control)
Desventajas
- Pérdida de presión a través del lecho
- Cuidado con las partículas sólidas suspendidas → colmatación
Biorreactores Pulsantes
- Sistemas recíprocos: Para incrementar la transferencia de materia como oxígeno en los equipos por aumento de la turbulencia. EJ.: producción de antibióticos, ácido cítrico, etanol, ácido acético.
- Sistemas no oscilantes: Para impedir que la retromezcla favorezca la inhibición por productos. Tiene tuberías elásticas conectadas a una electroválvula. Se genera una pulsación. EJ.: fermentación de hexosas por Saccharomyces cerevisiae inmovilizada por inclusión en k-carragenato.
Biorreactores Agitados por Fluidos
Mantienen las biopartículas en suspensión mediante el flujo de alimentación, por el gas desprendido o introduciendo un gas inerte.
- Se aproximan a un sistema de flujo pistón o totalmente homogéneo.
- Se minimizan los rozamientos.
- Buena eliminación de gas, biopartículas de pequeño tamaño, se minimizan los taponamientos.
- Biopartículas de menor tamaño que en lecho fijo → mayor superficie/volumen → mayor productividad.
- Además de inmovilización, se puede fomentar la floculación natural de las biopartículas evitando resistencias difusionales.
Desventajas
- Complejidad hidrodinámica provoca inestabilidad.
Lechos Fluidizados
- Un gas se dispersa en la zona inferior de una columna vertical en la que se encuentra un líquido (fase continua).
- Las burbujas de gas o la corriente líquida ascendente arrastran partículas sólidas → reactor de burbujeo/lecho fluidizado trifásico.
- La parte superior del equipo tiene un mayor diámetro la velocidad y así conseguir buena separación sólido/líquido/gas. Producción de cerveza, alcohol combustible, tratamiento de aguas (aerobio y anaerobio), cultivo de células animales, desulfuración microbiana de carbones, etc.
Ventajas
- Ideal para procesos inhibidos por producto.
- En cada plato se alcanza una gran mezcla.
Fermentadores Air-lift
- Recipiente con dos zonas: en una se inyecta gas (zona ascendente) y en otra no (zona descendente) → circulación.
- Diseño y construcción simples, bajos consumos energéticos, buena homogeneización, pero poca bibliografía al respecto. EJ.: producción de cerveza, vinagre y ácido acético.
Lecho Fluidizado VS Air-lift
| Lecho Fluidizado | Air-lift |
|---|---|
| • Velocidad no depende del gas • Caudales mas bajos por alta recirculación • Acumulación de gases en la parte superior • Coeficientes de transferencia menores |
• Velocidad depende del gas • Velocidad lineal mas alta sin recirculación • Poca acumulación de gases por turbulencia elevada • Coeficientes de transferencia mayores y mezcla más eficaz |
Fermentadores de Membrana. Sistemas de Retención Celular
Biorreactores de fibras huecas.
Desventaja
Baja eficacia por mala difusión, colmatación de las fibras, difícil purga del gas formado y ensuciamiento por interacciones componentes-membrana. EJ.: Separación de levaduras del caldo de fermentación mediante membranas semipermeables
Suministro de Oxígeno
Procesos altamente aerobios, pero con fragilidad de las células de los cultivos (células animales) → uso de fibras huecas para el aporte de oxígeno.
Desventaja
Módulo esterilizable. EJ.: Producción de anticuerpos monoclonales
Separación del Producto «In Situ»
- Biorreactor a vacío: Procesos inhibidos por producto → eliminación del producto. EJ.: Producción de etanol.
- Fermentación extractiva: Extracción con disolventes combinando eficacia e inocuidad para las células o enzimas – Co-inmovilización en alginato de levaduras y adsorción del disolvente en sílica-gel.
- Separación mediante membranas: Separación de un producto volátil del medio de cultivo – Diferencia de velocidades de permeación a través de una membrana, manteniéndose el vacío en la zona del permeado (baja presión, baja temperatura).
Biorreactores Air-lift
Son biorreactores con bajo consumo energético. Se realiza en recipientes divididos en dos zonas, de las cuales sólo se dispersa aire en una. Esto provoca que la retención de gas y la densidad aparente del líquido en las dos zonas sea diferente, lo que causa la circulación del fluido en el biorreactor. Se pueden obtener altas velocidades lineales del líquido sin recirculación, lo que mejora el grado de mezclado, la turbulencia, y la transferencia de masa y calor. Son biorreactores con bajo consumo energético.
Biorreactores de Tanque Agitado
Consiste en un reactor cilíndrico con un eje dirigido por un motor que hace girar uno o varios impulsores. Son los biorreactores más utilizados porque son más flexibles en las condiciones de operación, más fáciles de conseguir comercialmente, proveen una transferencia de gases eficiente a las células y son el tipo de biorreactor con el que más experiencia se tiene en la actualidad.
Agitación en Biorreactores
La agitación se refiere a forzar un fluido por medios mecánicos para que adquiera movimiento en el interior de un recipiente. PARA:
- Mezcla de dos líquidos miscibles.
- Disolución de un sólido en un líquido.
- Mejora de la transferencia de calor.
El agitador crea un cierto tipo de flujo dentro del sistema, dando lugar a que el líquido circule por todo el recipiente. La agitación efectiva proporciona a las células la concentración necesaria de sustratos, nutrientes, etc. Para que la agitación sea efectiva el fluido impulsado debe recorrer todo el recipiente en un tiempo razonable, y debe arrastrarlo a las partes alejadas del tanque y formar turbulencias.
Tipos de Agitadores
Los agitadores se clasifican en:
- Agitadores de flujo axial: generan corrientes paralelas al eje del agitador (hélices).
- Agitadores de flujo radial: generan corrientes en dirección radial o tangencial (turbina y paletas).
Los tres tipos más comunes de agitadores son:
- Paletas: sujetas a un eje giratorio, De fácil construcción, Producen una acción de mezcla suave, no requiere deflectores, Agitadores de ancla: se adaptan a la forma del fondo del tanque (evitar depósito de sólidos).
- Turbinas: Eficaces para un amplio intervalo de viscosidades, Agitadores de turbina de disco: aplicable para dispersar un gas en un líquido (la entrada del gas se coloca debajo del eje del rodete), Agitadores de turbina de aspas inclinadas: útil para sólidos en suspensión.
- Hélices: Operan a velocidad elevada (eficaces en tanques de gran tamaño) y se usan para líquidos poco viscosos.
Prevención de Vórtices
Cuando se emplean agitadores de aspas tipo turbina o de hélices para agitar fluidos de baja viscosidad se genera un vórtice. La profundidad del vórtice crece con la velocidad, hasta que eventualmente el vórtice pasa por el agitador.
- La eficacia de mezclado de un sistema con vórtice es menor.
Para evitar la formación de vórtices:
- Se instala placas deflectoras. Estas son placas verticales perpendiculares a la pared del tanque. El ancho de las placas no debe ser mayor que 1/12 del diámetro del tanque.
- Se instala el agitador fuera del eje central del tanque.
Importancia de la Agitación y la Aireación
¿Por qué es importante la agitación y la aireación en el diseño de biorreactores de tanque agitado? Los dos criterios más empleados en el escalado de biorreactores, se basan en mantener constante la Potencia de Agitación por unidad de volumen y el Coeficiente volumétrico de transferencia de materia.
Al introducir aire en un medio líquido previamente agitado hay una reducción instantánea de las necesidades de la potencia necesaria para su agitación.
La presencia de un gas produce cambios en la densidad alrededor del agitador, principalmente por la presencia de burbujas. Los cambios producidos son bastante significativos al comparar los niveles de potencia requeridos en un sistema sin aireación.
Etapas de Transferencia Difusional de Oxígeno
- Transferencia desde el interior de la burbuja de aire hasta la interfase gas-líquido.
- Movimiento a través de la interfase gas-líquido.
- Difusión a través de la película líquida relativamente inmóvil que rodea la burbuja.
- Transporte a través del seno del fluido.
- Difusión a través de la película líquida relativamente inmóvil que rodea las células.
- Movimiento a través de la interfase líquido-célula.
- Si las células están en un flóculo, agregado o partícula sólida, difusión a través del sólido hasta cada célula individual.
- Difusión a través de la envoltura celular.
- Transporte a través del citoplasma hasta el lugar de reacción.
La mayor resistencia a la transferencia de O2 la opone la película de líquido que rodea la burbuja de aire. Por tanto, es la etapa limitante del proceso y la que controla la velocidad global de transferencia de materia. Al burbujear aire se favorece la transferencia de gas al líquido. Para que la velocidad del sistema no esté limitada por el oxígeno, la velocidad de aporte, NO2 deberá ser siempre igual o mayor que la demanda de oxígeno.
En un cultivo en estado estacionario las velocidades de suministro y consumo deben ser iguales:
La determinación de la capacidad de transferencia de oxígeno del reactor, KLa, es esencial para establecer la eficiencia de aireación, y para cuantificar los efectos que tienen las variables de operación sobre la transferencia de oxígeno.
Métodos para Determinar la Transferencia de Oxígeno
Métodos Indirectos
- Ensayo sin población celular que simula las condiciones reológicas del sistema real (a mayor similitud mayor fiabilidad del resultado).
- Métodos más sencillos.
- El término de consumo es nulo (QO2 X = 0).
- Se determina la capacidad del sistema de aireación y agitación del biorreactor para conseguir que el líquido contenido en este absorba oxígeno.
Métodos Directos
- Ensayo durante el proceso de fermentación (resultados más fiables).
- Balance de oxígeno incluyendo el término de consumo.
- Se distinguen 2 métodos: el de estado estacionario y la técnica dinámica.
Factores que Afectan la Transferencia de Oxígeno
Grado de Agitación
La corriente de aire entra al biorreactor por debajo del agitador y al ser golpeado por las paletas se transforma en miles de pequeñas burbujas, ↑ a.
- Aumenta el área de intercambio por la ruptura de las burbujas Thorn aumenta a (área por unidad de volumen).
- Disminuye el espesor de la capa de líquido (L) por lo que aumenta el KL.
La presencia de tabiques deflectores impide la formación de vórtice. De este modo las burbujas no ascienden directamente hacia la superficie sino que quedan temporalmente retenidas por la circulación del líquido, ↑ NO2.
Aireación
El caudal de aire suministrado al biorreactor tiene una importancia relativa, debido a limitaciones de circulación. En general, si aumenta el número de burbujas Thorn aumenta el a y disminuye el L. Sin embargo, una velocidad superficial alta (vs= Qaire/ Sbiorreactor) provoca bajos tiempos de residencia del gas en el reactor, además de cavitación del agitador. El caudal de aire (Qaire) suministrado al biorreactor se mueve alrededor de 0,5 a 1,5 volúmenes de aire por volumen de biorreactor y por minuto.
Viscosidad
Afecta de forma importante a KLa. Se producen cambios de viscosidad durante la fermentación (en los procesos discontinuos) por el aumento de la concentración de microorganismos, la agregación de la biomasa (micelio, pellets), o la generación de metabolitos como polisacáridos. A mayor viscosidad, mayor resistencia a la transferencia: ↑ m ↓ KL a
Tensoactivos
Afectan al área de trasferencia y al KL y el efecto global depende de su concentración:
- Se generan burbujas más pequeñas: ↑ a ↑ KL a
- Aumenta la resistencia de la película ↑ L ↓ KL a
Sustancias orgánicas:
- Peptonas, micelio, biomasa: ↓ Kl a
- Antiespumantes: ↑ L ↓ KL a
- Alcoholes, cetonas y ésteres: ↑ KL a
Temperatura
Influye sobre coeficiente de difusión de O2 y la solubilidad (constante de Henry, C*):
↑ T ↑ DO2 ↑ KLa ↑ NO2 ↑ T ↓ C* ↓ NO2
Predomina un efecto u otro según el intervalo de temperatura:
- Tª de 10°C – 40°C: predomina el ↑ DO2: ↑ T → ↑ NO2
- Tª > 40°C: predomina ↓ C*: ↑ T → ↓ NO2
Presión
Al aumentar la presión aumenta la solubilidad del O2 en el líquido (ley de Henry):
C* = H⋅ PO2 ↑ P ↑ C* → ↑ NO
Cómo Aumentar la Transferencia de Oxígeno
- Aumentando el KLa
- Condiciones de operación (agitación, caudal de aire (vs ), etc.)
- Diseño del reactor (paletas, tabiques deflectores)
- Reología del cultivo (viscosidad)
- Aumentando la fuerza impulsora de la transferencia (C*- CL )
- Aumentar C* (presión)
- Aumentar la velocidad de agitación
► Enriquecer la corriente de aire en oxígeno
► Aumentar la velocidad superficial del aire*
► Aumentar el diámetro del agitador
► Colocar tabiques deflectores
► Emplear difusores de burbuja fina
► Usar un impulsor de turbina de disco
► Diluir el caldo de fermentación
► Disminuir la viscosidad del medio
► Variar el tamaño del inóculo
► Aumentar la presión
Sistemas para la Difusión de Aire
En la práctica, la aireación se realiza mediante compresores que suministran el aire a través de un medio poroso. El tamaño de las burbujas será proporcional al tamaño de poro del burbujeador/difusor.
- Difusores de burbuja fina: El problema es que se obstruyen fácilmente por la formación de depósitos en los poros del difusor, así como por la introducción de polvo y otras partículas en el aire que se inyecta, por lo que se requiere de una previa filtración del aire suministrado y de un mantenimiento más frecuente.
- Difusores de burbuja mediana y gruesa: no tienen este problema, pero la burbuja producida es de mayor tamaño, por lo que la eficiencia en transferencia de oxígeno es mucho menor que en los difusores de burbuja fina.
Desinfección y Esterilización
Desinfección
Eliminación de todos aquellos microorganismos que pueden causar daños específicos o resultados indeseables al proceso considerado.
Esterilización
Eliminación de todos los microorganismos presentes, capaces de competir con el organismo deseado en las condiciones de cultivo.
Métodos de Esterilización
Autoclave
La esterilización requiere de una exposición en su interior de unos 20-30 min a 120 °C a 1 atmósfera de presión.
Ventajas
- Rápido calentamiento
- Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
- No deja residuos tóxicos
- Hay un bajo deterioro del material expuesto
- Fácil manejo
- Económico
- Facilidad de control del proceso (automatización)
Desventajas
- No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua.
- Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.
- Deteriora los materiales sensibles al calo.
Estufa Poupinelle
Requiere de una exposición en su interior a 140-170 °C.
Ventajas
- Fácil manejo
- Es económica
- No es corrosivo para metales
- Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.
Desventajas
- Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.
- Necesita altas temperaturas y largos tiempos de exposición y no todos los materiales van a resistir esas temperaturas durante tanto tiempo.
Radiación Gamma y Beta
La capacidad destructiva de algunos tipos de radiaciones que son nocivas para los seres vivos, se aprovechan para eliminar microorganismos.
Ventajas
- Eficiencia prácticamente instantánea.
- Se realiza a presión y temperatura ambiente.
- No es corrosivo para metales.
- Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.
- Tienen una gran penetrabilidad y se utilizan para esterilizar materiales termosensibles.
Desventajas
- Se necesita una fuente de radiación e instalaciones blindadas con plomo.
Óxido de Etileno
El óxido de etileno es un gas inodoro, que es capaz de eliminar los microorganismos a 30-55 °C en muy poco tiempo.
Ventajas
- Es muy eficaz, destruye todos los microorganismos incluso virus.
- Puede esterilizar el material que no soporta altas temperaturas.
Desventajas
- El volumen del esterilizador es reducido.
- Se utilizan cartuchos unidosis de óxido de etileno.
- Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerígeno.
Plasma de Peróxido de Hidrógeno
El gas plasma de peróxido de hidrógeno es agua oxigenada sometida a ondas de radiofrecuencia, generando radicales libre que provocan la muerte de los microorganismos.
Ventajas
- Segura para el medio ambiente y para el trabajador.
- Fácil de manejar.
- Puede esterilizar materiales que no soportan el calor o la humedad.
Desventajas
- No esteriliza materiales que posean conductos o tubuladuras de menos de 3 mm de diámetro.
Vapor de Formaldehído
El vapor de formaldehído esteriliza porque es capaz de desnaturalizar las proteínas de los microorganismos e inhibir la actividad enzimática.
Desventajas
- Se necesitan largos tiempos de exposición.
- Es un producto tóxico.
Ácido Peracético
Consiste en preparar una solución alcalina al 2% de glutaraldehído donde se sumerge el materia a esterilizar durante 20-30 min, y posteriormente se enjuaga 10 min. Es el único esterilizante efectivo frío.
Esterilización del Medio de Cultivo
La esterilización por vapor es la más utilizada a nivel industrial cuando no hay problemas de termoestabilidad.
Esterilización Térmica del Medio de Cultivo
Mismo grado de esterilización utilizando diferentes estrategias:
- Altas temperaturas durante cortos periodos de tiempo.
- Bajas temperaturas durante más largos periodos de tiempo.
En general, largos tiempos de esterilización garantizan la destrucción de las especies más resistentes al calor como esporas pero perjudican a ciertos componentes del medio que presentan un cierto grado de termoestabilidad como vitaminas o aminoácidos.
Esterilización en Discontinuo
- Tiene una alta implementación práctica, menores costes de inversión, no necesidad de tener equipos dedicados, realizándose la esterilización en el mismo tanque de fermentación, mayor eficacia en el procesado de medios que contienen sólidos.
Esterilización en Continuo
- Reduce los tiempos de calentamiento/enfriamiento, asegura una reproducibilidad más alta del proceso, fácil automatización, mayor sencillez en el proceso de cambio de escala.
