Pero hacia finales del siglo XIX una serie de investigadores -algunos de ellos procedentes de áreas más clásicas de la Historia Natural- desarrollaron importantes estudios básicos que fueron revelando una enorme variedad de microorganismos y sus actividades metabólicas, así como su papel crucial en ciclos biogeoquímicos, sus relaciones con procesos de nutrición vegetal, etc. El descubrimiento de la quimioautotrofía, obra del gran microbiólogo ruso Sergei Winogradsky (1856-1953), obligó a revisar los conceptos previos, procedentes de la Fisiología Vegetal, de que el crecimiento autotrófico dependía de la presencia de clorofila. Winogradsky había comenzado  investigando las bacterias del hierro descubiertas por Cohn en 1875, observando que podían crecer en medios minerales, por lo que supuso que obtenían su energía de la oxidación de sales ferrosas a férricas (1888). En 1889, combinando técnicas de observación secuencial de cultivos microscópicos con ensayos microquímicos sobre bacterias del azufre (Beggiatoa, Thiothrix), infirió que estos microorganismos oxidaban sulfuro de hidrógeno hasta azufre elemental (acumulando éste como gránulos), y luego hasta ácido sulfúrico, obteniendo de este modo su energía. Estas observaciones pueden haber sido el arranque del concepto de litotrofía. Pero el descubrimiento de la quimioautotrofía llegó cuando al año siguiente Winogradsky y Omeliansky pasaron a estudiar las bacterias nitrificantes, demostrando de manera clara que la energía obtenida de la oxidación del amonio o del nitrito era usada para fijar CO₂ (1889-1890). Más tarde el mismo Winogradsky extendió la demostración a cultivos puros en los que el agente solidificante de los medios era el gel de sílice. La explicación del proceso de oxidación de los compuestos de azufre no llegó hasta los estudios de Dangeard (1911) y Kiel (1912). Nuevas capacidades metabólicas fueron reveladas al estudiar los procesos respiratorios de las bacterias que oxidan hidrógeno o metano (Söhngen, 1906).

El químico Berthelot había señalado (1885) que los microorganismos del suelo podían incorporar nitrógeno molecular directamente del aire. Fue igualmente Winogradsky el primero en aislar una bacteria capaz de fijar nitrógeno atmosférico (Clostridium pasteurianum) y en explicar el ciclo del nitrógeno en la naturaleza (1890), siendo el holandés Martinus Beijerinck (1851-1931) el descubridor de Azotobacter como bacteria aerobia fijadora de vida libre (1901). Más tarde Beijerinck demostró por métodos químicos que, en efecto, Azotobacter incorpora nitrógeno de la atmósfera mientras crece (1908). La importancia de la fijación de nitrógeno para la nutrición vegetal llegó con los estudios sobre bacterias formadoras de nódulos en las raíces de las leguminosas. Ya los experimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes, realizados por Boussingault a mediados del siglo XIX, habían indicado que las leguminosas asimilaban nitrógeno de la atmósfera. En 1866 Voronin descubrió las bacterias de los nódulos radicales de esta familia de plantas. Frank, en 1879, demostró que los nódulos parecían inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y Ward (1887) usó bacterias procedentes de nódulos machacados para inocular semillas, logrando la producción de nódulos en suelo estéril, y describiendo en un bello trabajo el proceso de infección, con su producción de “hifas” (cordón de infección). Tras la introducción del concepto de simbiosis por De Bary, en 1878, fue Schindler (1884) el primero en describir los nódulos radicales como resultado de una simbiosis entre planta y bacterias. Los trabajos de Hermann Hellriegel (1831-1895) y de su colaborador Hermann Willfahrt (1853-1904), que trabajaban en la Estación Experimental de Bernburg, comunicados en primer lugar en un congreso en Berlín, en 1886, y publicados en un artículo ejemplar en 1888, asociaron la fertilidad nitrogenada natural de las leguminosas con la presencia de sus nódulos radicales, señalando que estos nódulos se inducían por microorganismos específicos; de este modo lograron una brillante síntesis de las observaciones microbiológicas y químicas. El mismo año de 1888 Beijerinck logró el cultivo puro in vitro de las bacterias nodulares (a las que bautizó como Bacillus radicicola), observando que no reducían nitrógeno en vida libre; más tarde (1890) aportó la prueba definitiva de que las bacterias aisladas eran capaces de nodular específicamente ciertas especies de leguminosas, adquiriéndose de esta forma la facultad de fijar nitrógeno en su asociación con la raíz de la planta. Irónicamente el nombre definitivo para las bacterias de los nódulos de leguminosas (Rhizobium) fue propuesto por Frank, quien durante mucho tiempo se había negado a reconocer los resultados de Hellriegel y Willfahrt, y que había oscilado en sus opiniones, desde suponer que la fijación de nitrógeno era un rasgo general de las plantas, hasta creer que las estructuras intranodulares observadas a microscopio (bacteroides) eran gránulos de reserva (incluidas las que él mismo observó en plantas no leguminosas de los géneros Alnus y Eleagnus, originadas por una bacteria bautizada en su honor Frankia); incluso cuando se convenció de que los simbiontes eran bacterias (y no hongos o mixomicetes), pensaba que éstas sólo estimulaban a que las plantas fijaran nitrógeno en sus hojas; su “conversión” (y aún así incompleta y con reticencias) no llegó hasta 1892. El aislamiento de los bacteroides intranodulares (Prazmowski, 1890), y la relación entre su formación y la fijación de nitrógeno (Nobbe y Hiltner, 1893) completó esta primera oleada de investigación sobre este tema que tanta trascendencia presentaba para la Agronomía. Estos estudios están en la base de todos los ulteriores trabajos de Microbiología Agrícola, de modo que esta especialidad fue incorporada tempranamente a los laboratorios científicos y estaciones experimentales.

Las obras trascendentales de Winogradsky y Beijerinck abrieron un nuevo horizonte para el estudio de la diversidad microbiana. La escuela de Beijerinck, en la Universidad Técnica de Delft, fue continuada por A.J. Kluyver y C.B. van Niel, siendo este último el “padre” de la escuela norteamericana desde su establecimiento en California, ya que formó a figuras tan importantes como R.Y. Stanier, R.E. Hungate o M. Doudoroff. La escuela holandesa fundada por Beijerinck tuvo asimismo otra fructífera “colonia” en la ciudad alemana de Konstanz, donde N. Pfennig continuó el trabajo emprendido junto a van Niel en Delft. Todos estos autores, y sus colaboradores, fueron realizando contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la variedad de las bacterias fotosintéticas, los tipos de organismos litotróficos, y profundizando en multitud de aspectos estructurales y fisiológicos de las bacterias recién descubiertas.