ANTICUERPOS

La estructura básica de un anticuerpo: Formado por dos cadenas proteicas pesadas y dos ligeras, unidas por puentes disulfuro. Se dividen en varias clases que se identifican según el tipo de cadena pesada en: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. La acción de enzimas proteolíticas sobre los anticuerpos permite obtener fragmentos que presentan actividades biológicas diferenciales. Los fragmentos obtenidos son:

Fc

Corresponde al extremo C-terminal de las dos cadenas pesadas. Este fragmento está constituido por la región constante de la cadena pesada y es característica de cada clase de inmunoglobulinas. Es en esta región donde radican las funciones efectoras de la molécula como son la fijación del complemento, la interacción con los receptores celulares de monocitos y macrófagos, la interacción con la proteína A de S. aureus y G de Streptococcus sp. etc. La región Fc es característica de especie. Es una técnica para identificar componentes celulares o de los tejidos basándose en el principio de las interacciones entre los antígenos y anticuerpos.

Antígenos

Una molécula que induce la formación de un anticuerpo y que tiene uno o más lugares donde un anticuerpo puede unirse a ella. Esas regiones de la molécula que tienen la capacidad de unirse al anticuerpo están formadas por secuencias de aminoácidos o carbohidratos y se conocen como epítopes.

Anticuerpos

Un tipo de proteína sérica que se conoce como inmunoglobulina.

F(ab)2

Corresponde al extremo N-terminal de las dos cadenas pesadas y a las dos cadenas ligeras. Se obtiene por digestión con pepsina. Tiene reconocimiento divalente del epítopo.

F(ab)

Corresponde al extremo N-terminal de una cadena pesada y a una cadena ligera, unidas por puentes disulfuro. Se obtiene por digestión con papaína. Tiene reconocimiento monovalente del epítopo.

El uso de una u otra Ig en un procedimiento inmunocitoquímico está limitado por su poder de penetración en la muestra. Por ello las IgM son poco utilizadas, y el estándar es la IgG. Cuando se requieren anticuerpos de un menor tamaño se utilizan enzimas proteolíticos para aislar los fragmentos correspondientes que pueden conservar (F(ab)2) o no la capacidad divalente.

ANTÍGENOS, ANTIGENICIDAD E INMUNOGENICIDAD

Virtualmente toda molécula ajena a un determinado organismo se comporta frente a éste como un antígeno. Se pueden diferenciar dos características primordiales en un antígeno. Por una parte la inmunogenicidad o capacidad que presenta una molécula para generar una respuesta inmune en un organismo dado y la antigenicidad o particularidad del antígeno que hace que éste sea reconocido por un determinado anticuerpo. Ambas propiedades pueden o no estar presentes en un determinado antígeno. Moléculas de pequeño tamaño (haptenos o péptidos) son poco inmunogénicas y por ello se asocian a proteínas transportadoras de alto peso molecular o ‘carriers’ para inducir una respuesta inmune adecuada.

ANTICUERPOS POLICLONALES, MONOCLONALES, RECOMBINANTES

Cuando se inmuniza un animal con un antígeno y se provoca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig específicas del antígeno empleado. Esto es la consecuencia de la selección clonal de los linfocitos B que producen anticuerpos contra el antígeno. Como hemos visto un antígeno puede presentar diferentes epítopes, y cada uno de ellos ser reconocido por un clon de linfocitos B que producirá moléculas Ig con una secuencia característica. Por ello en el suero de un animal inmunizado se acumulan un número elevado de diferentes moléculas de Ig, específicas en mayor o menor medida de nuestro antígeno. Se trata de un suero producido por la acción de síntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal.

Los anticuerpos monoclonales se producen ‘in vitro’, y son la consecuencia de la actividad de síntesis de un único clon celular de linfocitos B que se ha aislado y se mantiene en cultivo en el laboratorio. El proceso de obtención de un anticuerpo monoclonal es complejo y se basa en la inmunización de un ratón Balbc.

Anticuerpos recombinantes

En la actualidad existe la tecnología necesaria para la producción de anticuerpos en ausencia de inmunización del animal. Es la denominada tecnología de los anticuerpos recombinantes. Los recientes avances en la tecnología génica han facilitado en gran medida la manipulación genética, producción, identificación y conjugación de fragmentos de anticuerpos recombinantes, obteniéndose nuevos anticuerpos multivalentes y multiespecíficos.

PROCESAMIENTO EN PORTAOBJETOS Y POR FLOTACIÓN ‘FREE FLOATING’

La detección inmunohistoquímica de un antígeno se puede realizar bien sobre secciones o muestras unidas a un portaobjetos o sobre cortes en flotación (‘free floating’).

El primer método se emplea para los tejidos incluidos en plástico o en parafina. Los cortes obtenidos mediante vibratomo, micrótomo de congelación y criostato se pueden procesar tanto sobre portaobjetos como por flotación.

En el procesamiento sobre portaobjetos es necesario unir los cortes a la superficie del portaobjetos. Esto se consigue empleando bien portas previamente gelatinados, con poli-l-lisina de 350000 Da o empleando portaobjetos con carga positiva.

En el caso de los cortes adheridos al portaobjetos es importante tener cuidado con los tratamientos proteolíticos pues pueden facilitar el despegamiento de los cortes. Las incubaciones se realizan mediante una gota que se deposita sobre la sección histológica. Para evitar la extensión de la gota se puede delimitar un área circular con lápiz hidrófobo.

En el proceso de flotación los cortes se recogen y procesan en recipientes especialmente diseñados: cilindros abiertos por la base que se ha cubierto con una fina malla (media). El protocolo inmunocitoquímico es rápido y sencillo. En cada recipiente se pueden procesar de 50 a 100 secciones. Todas las incubaciones y lavados se hacen con agitación constante, en un agitador rotatorio u orbital. Este procedimiento asegura la máxima penetración y homogeneidad de tinción.

PERMEABILIZACIÓN DEL TEJIDO

Este paso se realiza para facilitar el acceso de los anticuerpos al interior del tejido. El método más común es el tratamiento con una solución de detergente. En ocasiones este tratamiento es suficiente para asegurar una fácil penetración de los anticuerpos. Sin embargo es conveniente hacer el resto de incubaciones y lavados con soluciones que contengan una concentración más baja de detergente. La concentración de detergente se determina en cada caso y está muy relacionada con el tipo de fijación empleada. Si los cortes se han obtenido por congelación el pre tratamiento con detergentes no es estrictamente necesario, especialmente si el grosor del corte no supera las 6-8 µm. La utilización de detergentes en los procesos de inmunodetección de antígenos de membrana está contraindicada.

Un método alternativo de permeabilización consiste en congelar y descongelar el tejido repetidamente. Es un método sencillo pero que destruye la estructura y es poco repetible. Un tercer método consiste en el tratamiento con proteasas. Normalmente los cortes se someten a la acción de la pepsina, tripsina o pronasa. La concentración del enzima varía según el proceso histológico utilizado (fijación, grosor de los cortes, etc.), del antígeno a detectar y del tipo de tejido. Es obvio que un tratamiento fuerte con proteasas puede afectar gravemente la conservación estructural del tejido. Frecuentemente también provoca que el corte se desenganche fácilmente del portaobjetos, ya que las proteasas también digieren la gelatina. La digestión con proteasas es muy recomendable en el caso de tejidos fijados con altas concentraciones de glutaraldehído.

Un cuarto método consiste en tratar los tejidos con una escala creciente de etanol y finalmente sumergirlos en xilol. Este proceso permeabiliza extrayendo parte de los lípidos presentes en el tejido. Es muy eficaz y permite una conservación estructural óptima. No obstante no se puede emplear siempre ya que puede disminuir o eliminar la antigenicidad de algunos epítopes. Se emplea para incrementar la permeabilidad de cortes gruesos (>100 µm) y preparaciones enteras (‘whole mount’). Por último la fijación también puede facilitar la permeabilización, mediante el uso de tampones hipoosmóticos o de soluciones de pH variados (método del doble pH).

Los diferentes métodos de permeabilización no son excluyentes y existen protocolos en los que se emplean dos secuencialmente.

DESENMASCARAMIENTO DE EPÍTOPOS

El tratamiento de secciones desparafinadas con urea 3 M desenmascara epítopes. Otra estrategia que funciona en ocasiones es el tratamiento del corte con enzimas proteolíticos: tripsina, pepsina, quimotripsina y pronasa.

BLOQUEO DE UNIONES INESPECÍFICAS

Este paso tiene la doble función de bloquear los radicales libres reactivos presentes en el tejido de manera natural o introducidos como consecuencia de la fijación (generalmente de tipo aldehído) y saturar las uniones de los anticuerpos con proteínas. El primer objetivo se consigue saturando el tejido de moléculas de bajo peso molecular que reaccionan con radicales aldehído. Generalmente se emplea el borohidruro de sodio o el cloruro amónico.

Para el segundo objetivo se han probado diferentes estrategias: saturación de los cortes con una concentración elevada de albúmina sérica bovina (BSA), de suero preinmune de la especie donadora del segundo anticuerpo o de otra especie diferente a la donadora del primario, de suero bovino fetal (FCS) y con leche en polvo desnatada (Molico, Nestlé). En los métodos de inmunomarcaje indirecto o de puente es conveniente que el suero normal sea de la misma especie que la del anticuerpo secundario o alternativamente de especies filogenéticamente próximas.

SATURACIÓN DE PEROXIDASAS ENDÓGENAS

La eliminación de la actividad peroxidasa endógena sólo es necesaria cuando se emplea peroxidasa (HRP) como marcador. Se consigue incubando los cortes con una solución de peróxido de hidrógeno y metanol. De este modo se bloquea la actividad peroxidasa de las células, salvo de las sanguíneas. Es por ello recomendable que en los procedimientos que empleen HRP como marcador los tejidos se obtengan mediante perfusión.

INTERACCIÓN ANTÍGENO ANTICUERPO

Afinidad y avidez

La interacción entre antígeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces débiles, como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Wals e interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. La suma de todos estos enlaces genera una interacción estable entre el lugar de unión del anticuerpo (paratope) y el lugar de unión del antígeno (epítope). Estas fuerzas son inversamente proporcionales a una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que epítope y paratope deben presentar estructuras complementarias para obtener una energía de unión suficiente como para resistir la disrupción termodinámica. La suma de estas fuerzas de atracción y de repulsión se conoce como afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos son moléculas multivalentes en su interacción con el antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina presentan un máximo de 10 (IgM) y un mínimo de 2 brazos de unión con el antígeno. En el caso de que este último también sea multivalente, presentará un mínimo de dos puntos de anclaje para el anticuerpo correspondiente. Esta interacción multivalente entre antígeno y anticuerpo permite introducir el concepto de avidez o afinidad funcional.

Especificidad y reacción cruzada

La relación entre un antisuero o anticuerpo determinado y el antígeno que ha dado lugar a su producción se conoce como interacción específica. Cuando el antisuero da reacción positiva con otros antígenos, relacionados o no con el utilizado en la inmunización, se habla de reacción cruzada.

Un incremento en la fuerza iónica o la presencia de detergentes a bajas concentraciones sólo permiten el establecimiento de interacciones de alta afinidad. La utilización de agentes saturantes, por ej. soluciones de proteínas o aminoácidos pueden actuar como bloqueantes de grupos reactivos presentes en la preparación.