Determinación de Enzimas:

Cuantificación de la Actividad Enzimática

La cuantificación de los niveles enzimáticos en suero/plasma tiene valor diagnóstico o pronóstico en determinadas patologías. Dado que la cantidad de enzimas es muy baja y debido a su elevada actividad catalítica, es más fácil determinar la actividad de una enzima que la cantidad de enzima propiamente dicha.

Por tanto, determinando la cantidad de sustrato transformado por unidad de tiempo en condiciones definidas y estrictamente controladas, obtenemos la ACTIVIDAD ENZIMÁTICA, que es directamente proporcional a la cantidad de enzima presente en la muestra.

En la práctica, mantenemos constante la temperatura, el pH y la concentración de sustrato (10 veces superior a Km), por lo tanto estamos en la zona de la curva de orden cero y así podemos determinar la concentración de la enzima (que debe de ser el único factor limitador) en el espectrofotómetro de dos maneras:

• Midiendo el AUMENTO DE PRODUCTO formado a lo largo del tiempo de la reacción.
• Midiendo la DISMINUCIÓN DE SUSTRATO a lo largo del tiempo de reacción.

Límite de Linealidad

Es importante conocer el concepto de LÍMITE DE LINEALIDAD cuando estamos determinando enzimas. Para ello hay que tener en cuenta que en una reacción enzimática, el producto formado aumenta proporcionalmente a la concentración de la enzima, hasta que la concentración de enzima excede a la cantidad de sustrato disponible y se agota todo el sustrato antes de que finalice la monitorización de la reacción. En este momento, la reacción deja de ser lineal y no refleja la actividad enzimática.

Monitorización de la Reacción

Toda determinación cinética necesita realizar varias lecturas a tiempos determinados (monitorización) que nos confirma la reacción de orden cero o la velocidad de transformación constante.

A partir del minuto 5, la cantidad de sustrato no es suficiente para conseguir una velocidad constante, se ha agotado antes de que terminara el periodo de lectura de 10 minutos que dura la técnica (ejemplo: El DA se va haciendo cada vez menor a partir de este momento).

Métodos Cinéticos

Los métodos cinéticos pueden ser de dos tipos:

• Métodos cinéticos colorimétricos: se basan en la comprobación de un aumento de producto formado o una disminución del sustrato mediante una reacción coloreada, por ejemplo, la técnica de la fosfatasa ácida.
• Métodos cinéticos con NAD+/NADH+H+ y NADP/NADPH+: basadas en que las formas reducidas de los coenzimas absorben la luz ultravioleta a 340 nm, mientras que las formas oxidadas no absorben a esa longitud de onda.

Aspectos Prácticos:

Condiciones de la Muestra

Condiciones de la muestra para garantizar la calidad del resultado:

• No utilizar muestras que hayan sido congeladas y descongeladas varias veces, ya que es causa de desnaturalización irreversible de la proteína, provocando falsos negativos.
• No poner los sueros para las determinaciones enzimáticas en tubos lavados con productos detergentes que pueden alterar la estructura proteica de la enzima, provocando falsos negativos.
• Separa lo antes posible el coágulo del suero, pues ciertas enzimas como, por ejemplo, el LDH y PAC son componentes de los trombocitos y se liberan al medio si existe destrucción de los mismos, provocando falsos positivos si no se procede a la pronta separación.
• No trabajar con muestras hemolizadas ya que se encuentran elevados los componentes intraeritrocitarios y se vierten al medio, como por ejemplo en la determinación de LDH y ASP, provocando falsos positivos.
• Evitar el éstasis venoso prolongado durante la extracción, pues este produce hipoxia y un aumento de la permeabilidad de las células sanguíneas.
• Evitar el envejecimiento de las muestras, sobre todo en la determinación de CK y FAC que son muy lábiles.
• El transporte de muestras destinadas a la determinación de enzimas debe hacerse en frío sin congelar.

Condiciones de los Reactivos y del Instrumental

Condiciones de los reactivos y del instrumental:

• Revisar la fecha de caducidad de los reactivos, sobre todo que no se deteriore las soluciones de sustrato.
• Cuando se recibe un pedido, comprobar que ha sido enviado correctamente en la forma establecida para preservar el contenido.
• Revisar las condiciones de almacenamiento y temperatura adecuada de las neveras.
• Cuando se reconstituye un reactivo, anotar la fecha y seguir las instrucciones del laboratorio fabricante frente al almacenamiento y nueva fecha de caducidad.
• Diluir los sueros cuando la reacción esté fuera de la linealidad, de esta forma disminuye la cantidad de enzima y con ello la actividad enzimática y el sustrato presente en el reactivo puede ser suficiente.
• El espectrofotómetro para las determinaciones cinéticas, tiene que tener dos características esenciales: una, debe de permitir lecturas fiables a la longitud de onda de ensayo y dos, debe de tener sistema regulador de la temperatura para mantener la temperatura de trabajo deseada con un margen de +/-01ºC.
• Hay que utilizar pipetas adecuadas, ya que se coge muy pequeña cantidad de muestra.

Control de Calidad

Control de calidad:

• Introducción de sueros control, antes que las muestras problema.
• Comprobar cada día, los resultados de los controles internos.
• Comprobación de los resultados no esperados.

Valoración de Resultados:

Marcadores Bioquímicos

1. Marcadores Bioquímicos del Infarto de Miocardio

El infarto de miocardio suele ser el resultado de la oclusión aguda de una arteria coronaria, bien por la ruptura de una placa arteriosclerótica o por un trombo sobreañadido a una lesión ateriosclerótica. Como consecuencia de la oclusión no hay aporte sanguíneo a una parte del músculo cardíaco, y este sector del corazón muere.

Las consecuencias del infarto dependen de la gravedad de la lesión, es decir, de la parte de músculo cardíaco que se necrose y de las estructuras cardíacas que hayan quedado afectadas.

Su diagnóstico se realiza por:

• Dolor característico
• Electrocardiograma (ECG)
• Marcadores químicos cardíacos

En el inicio de un infarto de miocardio los cambios que presenta el ECG son insignificantes en un 20% de los casos y no diagnósticos en el 30-50%.

El aumento de la concentración de enzimas de origen cardíaco presenta su mayor valor clínico en relación con el tiempo transcurrido desde el inicio del infarto.

En la actualidad se utilizan los MARCADORES BIOQUÍMICOS CARDÍACOS:

• Marcadores clásicos: CK-MB, LDH y ASAT (GOT).
• Marcadores de daño miocárdico: TROPONINAS CARDÍACAS (TnT y TnI) y MIOGLOBINA.

2. Marcadores Bioquímicos de la Pancreatitis Aguda

LIPASA – AMILASA

La lipasa y amilasa en sangre aumentan a las 6-8 horas dándose la máxima concentración a las 20-30 horas, se normalizan al octavo día.

La amilasa en orina aumenta a las 5-8 horas después del aumento en sangre y puede mantenerse varios días después de haberse normalizado en sangre.

3. Marcadores de las Hepatitis Víricas Agudas

Aumenta ALT (GPT) en mayor cantidad que AST (GOT).

Aumenta ã-GT y se normaliza de 3 a 5 semanas.

En las hepatitis fulminantes: disminución brusca de las transaminasas.

En la hepatitis crónica: los enzimas no llegan a normalizarse.

4. Marcadores de la Colestasis

Aumenta la enzima ã-GT y Fosfatasa alcalina.

5. Alcohol, Etilismo Crónico

Aumenta la enzima ã-GT.

6. Marcador de la Cirrosis Hepática

Aumento moderado de AST>ALT.

Si es de origen etílico: aumenta gama GT.

Si es de origen biliar: aumenta Fosfatasa Alcalina.

7. Medicamentos

Producen interferencias analíticas.

Pueden modificar los valores fisiológicos al provocar un mecanismo de inducción enzimática.

El fármaco en sí puede provocar hepatotoxicidad.

8. Neoplasias

Aumento inespecífico de LDH.

Cáncer de próstata: aumenta la Fosfatasa Ácida.

Metástasis hepáticas: aumenta la Fosfatasa Alcalina, ã-GT (y marcadores del cáncer original).

Metástasis óseas: aumenta la Fosfatasa Alcalina.

Tecnología del ADN:

Estudio de los Ácidos Nucleicos

El ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) son MACROMOLÉCULAS que tienen como función el ALMACENAMIENTO y LA TRANSFERENCIA DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA. Así como las proteínas tienen como unidad estructural los aminoácidos, los ácidos nucleicos tienen como unidad básica los NUCLEÓTIDOS y, si las proteínas se diferencian entre sí por los aminoácidos que las componen, los ácidos nucleicos se distinguen por la secuencia de bases características de sus nucleótidos.

Nucleótidos

1.1 NUCLEÓTIDOS:

Los ácidos nucléicos son cadenas de nucleótidos.

Cada nucleótido está formado por la unión de un nucleósido y de una molécula de ácido fosfórico.

A su vez, cada nucleósido está formado por la unión de un azúcar (pentosa) y una base nitrogenada.

Así pues, los componentes de un nucleótido son:

• Molécula de azúcar (pentosa): _Ribosa, en el caso del RNA._ Desoxirribosa, en el caso del ADN.
• Base nitrogenada, que puede ser: __Base púrica: Adenina y Guanina. __Base pirimidinica: Citosina, Timina y Uracilo.

En el ADN las bases nitrogenadas pueden ser: Adenina, Guanina, Citosina y Timina.

En el ARN las bases nitrogenadas pueden ser: Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo.

La base nitrogenada se une al carbono 1 del azúcar.

Según el tipo de azúcar que contienen los ácidos nucléicos se dividen en:

• RIBONUCLEICOS (ARN) -contienen RIBOSA- y
• DESOXIRRIBONUCLEICOS (ADN) -contienen DESOXIRRIBOSA-.

Acido fosfórico:

Cuando el azúcar de un nucleósido se esterifica con ácido fosfórico se obtiene un NUCLEÓTIDO.

El ácido fosfórico se une al carbono 3 o 5 del azúcar.

La posición 5 del azúcar puede estar esterificada con una, dos o tres moléculas de ácido fosfórico, lo que da lugar a los nucleótidos monofosfato, difosfato o trifosfato.

Los ribonucleótidos trifosfato (ATP, GTP…) y los desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP…) son los PRECURSORES QUE UTILIZAN LAS CÉLULAS PARA LA SÍNTESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS, dando lugar respectivamente al ARN y al ADN.

Los nucleótidos trifosfato actúan también como TRANSPORTADORES DE GRUPOS FOSFATO en diversas reacciones enzimáticas importantes y la transferencia de estos grupos fosfato está asociada a CAMBIOS DE ENERGÍA QUÍMICA en las reacciones celulares.

Algunos nucleótidos forman parte de varias COENZIMAS que intervienen en REACCIONES DE TRANSFERENCIA DE ELECTRONES, como por ejemplo:

• NAD (nicotinamida adenina dinucleótido)
• NADP+
• FMN (flavin mononucleótido).

Los NUCLEÓTIDOS CÍCLICOS que se forman por la ciclación del fosfato en las posiciones 3 y 5 del azúcar actúan como SEGUNDOS MENSAJEROS DE LA ACCIÓN HORMONAL dentro de las células; como por ejemplo: AMPc y GMPc…

Componentes de un nucleótido:

Enlace nucleotídico:

La unión por ENLACE FOSFODIESTER entre el grupo hidroxilo de la posición 3 del azúcar y el grupo fosfato de la posición 5 de otro nucleótido da lugar a un DINUCLEÓTIDO.

Así podremos hablar de:

• Oligonucleótidos: unión de
• Polinucleótidos: unión de > 10 nucleótidos.

ESTUDIO DE LOS ACIDOS NUCLEICOS:

Componentes de un nucleótido:

En TODOS los polinucleótidos hay un extremo llamado extremo 3 que posee el grupo -OH de la posición 3 del azúcar libre; y un extremo 5 que posee el grupo fosfato libre.

Se emplea una notación simplificada para nombrar un polinucleótido en la cual se indica solamente la secuencia de las bases nitrogenadas y los extremos 5 y 3.

5-ATTCGACGGT- 3.

ADN

ADN:

En las células eucariotas está localizado casi exclusivamente en el núcleo celular, asociado a proteínas básicas (histonas), formando la CROMATINA, que puede observarse en los CROMOSOMAS durante la división celular.

En las mitocondrias existe una pequeña cantidad de DNA diferente del DNA del núcleo.

En las células procariotas el DNA se encuentra libre en el citoplasma, unido a la membrana plasmática.

La cantidad total de DNA de una célula se denomina GENOMA.

El ADN contiene TODA la información necesaria para el DESARROLLO de las CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS de un individuo y las instrucciones para que las células lleven a cabo sus FUNCIONES.

Está formado por la unión de DOS CADENAS DE DESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS, es decir que el azúcar que contienen es desoxirribosa.

Las bases que podemos encontrar son : adenina, guanina, citosina y timina.

La ESTRUCTURA PRIMARIA viene dada por la secuencia de los nucleótidos en cada una de las cadenas.

El ORDEN de la secuencia de nucleótidos es muy importante ya que en él reside la información contenida en el ácido nucléico.

ESTRUCTURA SECUNDARIA:

Watson y Crick en 1953 establecieron que el modelo de estructura del ADN consistía en una doble hélice antiparalela cuyo esqueleto fundamental está formado por las cadenas de azúcar-fosfato, quedando en la parte central las bases, enfrentadas las de una cadena con las de la otra complementaria estableciendo entre sí puentes de hidrógeno, factor que da estabilidad a la doble hélice.

Por lo común su estructura tridimensional posee giro hacia la derecha (ß-ADN, dextrogiro) que es la forma más estable y ocasionalmente posee giro hacia la izquierda (z-ADN, levógiro).

El enfrentamiento de las bases es constante;

• La adenina siempre se enfrenta con la timina, formado entre ellas dos puentes de hidrógeno y la guanina con la citosina, formándose entre ambas tres puentes de hidrógeno.

Esta característica provoca que las dos cadenas sean COMPLEMENTARIAS.

Las dos cadenas de la doble hélice tienen sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5´-3´; la otra lo hace en sentido 3´- 5´; por eso hablamos de una doble hélice ANTIPARALELA.

Esta estructura es la que presentan la mayoría de las células y virus. Sin embargo, algunas bacterias contienen DNA con una estructura de doble cadena cerrada en anillo. También algunos virus poseen DNA de una sola cadena.

ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR:

En el caso de las células eucariotas el ADN nuclear puede alcanzar hasta 1,80 m. de longitud y para que pueda caber dentro del núcleo celular, que mide unos 10 mm, deberá empaquetarse para ocupar un espacio mínimo.

Para ello el ADN se asocia con unas proteínas denominadas HISTONAS y adopta en su empaquetamiento niveles de complejidad creciente.

La asociación del ADN con las histonas se conoce como CROMATINA.

La unidad fundamental de la cromatina es el NUCLEOSOMA.

El NUCLEOSOMA está formado por un octámero de histonas en forma de disco alrededor del cual se enrollan dos vueltas de ADN.

Los diferentes nucleosomas aparecen unidos por segmentos de ADN dando el aspecto de un COLLAR DE PERLAS.

El collar de perlas sufre un enrollamiento sobre sí mismo dando lugar al SOLENOIDE o fibra cromatínica de 30 nm, que es el nivel de empaquetamiento que presenta el ADN cuando se encuentra en estado de CROMATINA; es decir cuando está empaquetado en el interior del núcleo celular y, al mismo tiempo, sus genes resultan accesibles para su transcripción y replicación.

Cuando la célula entra en mitosis, la cromatina se empaqueta aún más para formar BUCLES RADIALES, estos se enrollan para dar sucesivamente ROSETONES, ESPIRALES DE ROSETONES y por fin los CROMOSOMAS que son visibles al microscopio óptico.

REPLICACIÓN DEL ADN:

El material genético debe ser capaz de copiarse a sí mismo para que las células hijas contengan la misma información genética de la célula madre de la cual proceden, esto se consigue con el proceso conocido como

¨La replicación del ADN es SEMICONSERVATIVA, es decir que a partir de una molécula de ADN se obtendrán dos moléculas hijas cada una de las cuales estará formadas por una cadena original (cadena molde) y una cadena complementaria de nueva síntesis.

La replicación del ADN consiste en:

• 1º. Separación de las dos cadenas que forman la doble hélice, de lo cual se encargan enzimas (HELICASA) y proteínas que se encuentran en la célula eucariota.
• 2º. Unión de los CEBADORES (primers o iniciadores) de RNA en cada una de las hebras separadas. Este ARN cebador lo fabrica una ARN polimerasa llamada PRIMASA.
• 3º. Unión de la enzima ADN polimerasa III a los lugares donde se encuentra el primers para comenzar a copiar la hebra de DNA, ya que la polimerasa necesita un cebador que le indique dónde empezar, por ser incapaz de copiar DNA monocatenario. El sentido de la síntesis siempre es 5´- 3´.

Como la DNA polimerasa sólo puede sintetizar DNA en la dirección 5´-3´, una de las hebras deberá ser sintetizada de forma discontínua, esto lleva a la formación de cortas cadenas de DNA (fragmentos de Okasaki). Cada uno de estos fragmentos requiere un ARN cebador.

Posteriormente por acción de la DNA polimerasa I se elimina el ARN cebador y se completa el vacío dejado por este. Los fragmentos de Okasaki son finalmente unidos por la ADN ligasa.

4. Constitución de las nuevas copias siempre formadas por una hebra madre y otra hija.

DESNATURALIZACIÓN DEL ADN:

Cuando la temperatura alcanza determinado valor (llamado punto de fusión del ADN), las dos cadenas se SEPARARÁN (ruptura de los puentes de hidrógeno) produciéndose la desnaturalización del ADN.

Este es un fenómeno REVERSIBLE, es decir que si una disolución de ADN calentado ligeramente por encima de su punto de fusión y desnaturalizado, al enfriarse puede volver a recuperar su forma inicial de doble hélice: RENATURALIZACIÓN.

La única condición para que dos cadenas recuperen la estructura de doble hélice es que sean COMPLEMENTARIAS o, al menos, que posean tramos con secuencias complementarias suficientemente largos.

Las variaciones bruscas de pH también provocan desnaturalización del ADN, que se renaturaliza cuando los valores de pH se sitúan dentro de los parámetros biológicos.

La reversibilidad de la desnaturalización ha dado lugar a una importante aplicación conocida como HIBRIDACIÓN que constituye una de las técnicas fundamentales en la tecnología del ADN recombinante, fundamento de la ingeniería genética o biotecnología.

ARN

ARN:

El RNA es un POLIRRIBONUCLEÓTIDO.

Se diferencia del ADN en que contiene RIBOSA y en que las bases nitrogenadas que contiene son ADENINA, GUANINA, CITOSINA Y URACILO. El uracilo se empareja con la adenina.

En algunos tipos de ARN, especialmente el ARNt se pueden encontrar otras bases especiales derivadas de aquellas, como el dihidrouracilo, metilguanina, etc.

Las cadenas de ARN son más cortas que las de ADN y pueden aparecer tanto en el citoplasma como en el núcleo celular.

El ARN es el encargado de transmitir el mensaje genético codificado por el ADN y de sintetizar las proteínas específicas.

Los ARNm se sintetizan en el núcleo en un proceso denominado TRANSCRIPCIÓN, en el que se forman como complemento de una zona de una de las cadenas de DNA.

Los RNAm están formados por una larga cadena de ribonucleótidos y su tamaño varia según la proteína que codifican.

RNAm:

Cada RNAm contiene la información necesaria para la síntesis de una proteína. Cada secuencia de tres bases se llama codón y codifica un aminoácido.

Su vida media citoplasmática es muy corta y se degradan rápidamente una vez sintetizadas las proteínas.

Las moléculas de ARN suelen tener únicamente estructura primaria (MONOCATENARIO), aunque en algunos casos existen ciertas regiones de una misma cadena que poseen secuencias complementarias capaces de aparearse y formar estructuras secundarias (doble hélice) y terciarias.

Sólo se ha descrito un ARN bicatenario con estructura en doble hélice en un tipo de virus, los reovirus.

Existen varios tipos de ARN.

RNAt:

Actúan como TRANSPORTADORES Y ACTIVADORES DE LOS AMINOÁCIDOS en el proceso de síntesis de las proteínas.

Los RNAt son los ácidos ribonucleicos más pequeños y constan de 70 a 90 nucleótidos y se caracterizan por la presencia de bases poco frecuentes.

Cada molécula de ARNt transporta UN AMINOÁCIDO ESPECÍFICO.

En una zona de la molécula se encuentra el ANTICODON, que es un triplete de bases complementario con el codon del ARNm.

Todos los ARNt presentan una ESTRUCTURA SECUNDARIA que se conoce como hoja de trébol, en que algunas zonas de la molécula se aparean formando una doble hélice. A su vez presenta una estructura terciaria en forma de L compacta.

ARN RIBOSÓMICO (ARNr):

Representan el 80% del ARN celular.

Son moléculas de diferentes tamaños con estructura secundaria y terciaria.

Los RNAr se asocian a diferentes proteínas para formar los RIBOSOMAS, que son los orgánulos citoplasmáticos en los que se produce la SÍNTESIS DE PROTEÍNAS.

Toda la información necesaria para la génesis, el desarrollo y la vida de un organismo se encuentra escrita en forma de código en la secuencia de bases de las largas cadenas de ADN.

En general, puede considerarse que un gen es un segmento de ADN que contiene la información necesaria para que se sintetice una proteína determinada.

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR: TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN:

El mensaje genético se transmite en dos etapas sucesivas en que el ARN es un intermediario imprescindible:

TRANSCRIPCIÓN de la información genética:

Una de las cadenas del ADN del gen sirve como molde para sintetizar una cadena de ARNm que tiene la secuencia complementaria. Este ARNm se sintetiza con la intervención de la ARN polimerasa y posteriormente será transportado desde el núcleo a los ribosomas que se encuentran en el citoplasma.

TRADUCCIÓN de la información genética:

En los ribosomas, a partir de la información contenida en el ARNm se sintetiza la proteína correspondiente; es decir traduce la secuencia de bases del ARN en la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína.

TRADUCCIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA:

El desciframiento del código genético consistió en descubrir la relación entre la secuencia de nucleótidos de ARNm (y por tanto del ADN) y la secuencia de aminoácidos de la proteína.

Básicamente tres bases nitrogenadas de ARNm codifican un aminoácido (el número posible de combinaciones de bases es 64, suficiente para codificar 20 aminoácidos).

-.-.A cada triplete de bases del ARNm se le denomina CODÓN. Algunos aminoácidos están codificados por más de un codón pero ningún codón codifica más de un aminoácido.-.-.-Hay codones que indican el principio de síntesis, CODÓN DE INICIACIÓN y el final, CODÓN DE TERMINACIÓN de la proteína.-.-.-.En los ribosomas, a partir de la información contenida en el ARNm (tripletes de bases nitrogenadas) se sintetiza la proteína correspondiente, es decir, TRADUCE la secuencia de bases del ARNm en la correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína