Pruebas Bioquímicas

¿Qué son las pruebas bioquímicas?

Son test químicos aplicados a medios biológicos que, conociendo su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su funcionamiento consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria, al crecer, utiliza o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

Batería de Pruebas Químicas

• TSI
• LIA
• CIT
• F.A
• Gelatina
• MIO
• R.M
• Malonato
• Urea
• Descarboxilasas

Se requiere conocer a detalle cómo se producen estos cambios, cómo ocurren paso a paso las reacciones químicas, cuáles enzimas intervienen y cuáles son los productos intermedios. En general, el medio se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva específica o sustrato.

Medios de Cultivo y Pruebas Específicas

Triple Sugar Iron Agar (TSI)

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología para la identificación de enterobacterias en base a la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa.

Citrato de Simmons

Determina si el organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono y compuesto amoniacal como fuente de nitrógeno.

• El fosfato monoamónico es la fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono, ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano.
• Las sales de fosfato forman un sistema buffer.
• El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
• El magnesio es cofactor enzimático.

Indicador Azul de Bromotimol

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno.

El metabolismo del citrato se realiza en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa a través del ciclo del ácido tricarboxílico.

El desdoblamiento del citrato produce piruvato que, al ser utilizado como fuente de carbono, produce carbonatos y bicarbonatos alcalinos.

Resultados

• Positivo: crecimiento y color azul en el pico de flauta (alcalinidad).
• Negativo: presencia de crecimiento y el medio permanece de color verde.

Malonato

Su objetivo es determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono con la resultante alcalinidad.

El malonato es un inhibidor enzimático, interfiere en la oxidación del ácido succínico deshidrogenasa.

En consecuencia, la acumulación de ácido succínico a causa de la inhibición de la succinato deshidrogenasa interrumpe el ciclo de Krebs, lo que priva a los microorganismos de su fuente de energía y también interfiere en el ciclo del glioxilato, lo que interfiere en la producción interna de intermediarios requeridos para la biosíntesis de nuevos compuestos necesarios para el metabolismo.

Rojo de Metilo – Voges Proskauer

Se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener productos finales ácidos (vía de los ácidos mixtos) estables por fermentación de la glucosa y para determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir productos finales neutros (acetil-metilcarbinol o acetoína) a partir de la fermentación de la glucosa.

Fermentación Ácido Mixta

Los productos son ácidos orgánicos (ácido acético y fórmico) que producen un descenso del pH por debajo de 4.4, formando un anillo rojo al agregar el indicador.

Fermentación Butilenglicólica

En esta, parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de ácido láctico, fórmico y acético (son neutros).

Agar Hierro Lisina (LIA)

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella sp., basado en la descarboxilación/desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico. El medio pone de manifiesto si la bacteria posee la enzima descarboxilasa o desaminasa.

• La descarboxilación de la lisina tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
• Los microorganismos que no producen lisina descarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la tonalidad del medio de cultivo al amarillo y a las 24 horas de incubación se observa el pico de flauta color violeta / el fondo amarillo.
• La desaminación de lisina tiene lugar en la parte superior del tubo y su compuesto final es el ácido carbónico que, al combinarse con las sales de hierro y la presencia de oxígeno, produce un color rojo.
• Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella desaminan la lisina.

Resultados

• Descarboxilación de la lisina: prueba positiva: pico de flauta violeta / fondo violeta (K/K). Prueba negativa: pico de flauta violeta / fondo amarillo (K/A).
• Desaminación de la lisina: pico rojo / fondo amarillo (R/A).
• Producción de ácido sulfhídrico: prueba positiva: ennegrecimiento del medio.

Prueba de la Fenilalanina Desaminasa (PPA)

Determina la capacidad de una bacteria para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por acción de la enzima fenilalanina desaminasa con la consiguiente acidificación.

Interpretación

La acidificación del medio se va a poner de manifiesto mediante la aplicación de FeCl₃ al 10%. Si hay en el medio ácido fenilpirúvico, aparece una coloración verde-azulada.

Medio MIO

Medio usado para la identificación de enterobacterias en base a su movilidad, actividad de ornitina descarboxilasa y producción de indol.

Movilidad

La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea de inoculación.

Ornitina

La reacción positiva está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se produce una condición ácida, originando que el indicador vire al amarillo.

La presencia de acidez otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa, la cual descarboxila la ornitina presente.

Por descarboxilación, se forma putrescina, que alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.

Prueba de Indol

Pone de manifiesto la presencia de la enzima triptofanasa. Si está presente, degradará el triptófano y liberará al medio indol. Para revelar su presencia, usaremos el reactivo de Kovacs.

Agar Urea de Christensen

Medio utilizado para la identificación de microorganismos en base a la actividad ureásica. Útil para diferenciar Proteus sp. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Pone de manifiesto la actividad de la enzima ureasa para degradar la urea en dos moléculas de amoníaco.

Resultados

• Negativo: se torna naranja o permanece del mismo color.
• Positivo: se torna color rosa.

Preguntas de Examen

1. La reacción positiva a la ornitina está dada por un color amarillo del medio por la fermentación de glucosa que produce el pH y otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima.

Falso

2. La prueba de fenilalanina determina la capacidad de la bacteria para descarboxilar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por la acción de la enzima fenilalanina descarboxilasa, esto va a producir una acidificación del medio.

Verdadero

3. En Voges-Proskauer, la fermentación butilenglicólica parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de ácido láctico, fórmico y acético.

Verdadero

4. Las pruebas del citrato se realizan en aquellas bacterias poseedoras de deshidratasas citratasas, a través del ciclo de glioxilato. El desdoblamiento del citrato produce lactato que, al ser utilizado como fuente de carbono, produce carbonatos y bicarbonatos alcalinos.

Falso

5. La alicina de saminasa requiere un medio alcalino, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.

Falso