Técnica:

Atemperar muestra y material a 37ºC. Depositar dos gotas de semen (10 μl) previamente licuado (30 minutos como mínimo a temperatura ambiente) y homogeneizado sobre un portaobjetos a 37º C. Cubrir con un cubreobjetos sin apretar ni dejar burbujas. Para evitar la desecación de la muestra podemos untar con vaselina los bordes del cubreobjetos antes de situar el mismo sobre el portaobjetos. Dejar estabilizar la preparación unos 60 segundos. Comprobar que la movilidad de los espermatozoides es semejante en ambas gotas observando la muestra a 10x y, en caso contrario, se realiza otra preparación. Observar al menos 25 campos con un objetivo de 40x o contar 200 espermatozoides anotando en primer lugar los espermatozoides progresivos rápidos y lentos (clases a y b de la OMS) y a continuación, en el mismo campo, los espermatozoides no progresivos (clase c de la OMS) e inmóviles (clase d de la OMS). Repetir en la otra gota.

Observaciones:

• El resultado obtenido en ambas gotas no debe diferir más de un 10%.
• La zona de lectura recomendada es a partir de 5 mm de los bordes de la preparación.
• Es importante enfocar a través de todo el grosor del campo para contar los espermatozoides inmóviles que pueden encontrarse en el fondo del medio.
• Los resultados se informan en PORCENTAJES DE CADA UNA DE LAS FORMAS OBSERVADAS.
• Inicialmente es complejo sobre todo en muestra con mucha movilidad. Se aconseja contar por series.
• Las formas móviles disminuyen un 5% por hora a partir de la cuarta hora de la recogida.
• Si más de un 25% de los espermatozoides se encuentran AGREGADOS, la valoración de la movilidad se realizará sólo con los espermatozoides libres, haciendo constar en el informe este problema.
• Las cabezas sin flagelo NO deben contarse.
• Las colas sueltas no se cuentan.
• Viscosidad muy elevada: puede parecer astenozoospermia y contajes dispares.
• Elevado número de células redondas con las que, al chocar los espermatozoides, pueden frenar su marcha.

Se informa un PROMEDIO DE LOS RESULTADOS, es decir, porcentaje de espermatozoides que presentan movilidad (a+b+c) y porcentaje de espermatozoides inmóviles:-Se califica de normal a los 60 minutos de la eyaculación:- = 50% de espermatozoides con movilidad tipo a + b.- = 25 % con movilidad tipo a.- Valores inferiores o iguales a los anteriores astenospermia.

Hay que tener en cuenta:

• Las colas sueltas no se cuentan.
• La presencia de agregaciones o aglutinaciones: la valoración se hará sobre las formas móviles.
• Concentraciones muy elevadas.
• Viscosidad muy elevada: puede parecer astenozoospermia y contajes dispares.
• Elevado número de células redondas con las que, al chocar los espermatozoides, pueden frenar su marcha.

4.2.3 Índice de vitalidad (Test de Williams Pollack):

Los espermatozoides INMÓVILES pueden estar vivos o muertos.-.-.Si la cantidad de espermatozoides inmóviles supera el 50% se puede determinar la proporción de espermatozoides vivos con técnicas de tinción supravital.-.-Los espermatozoides muertos presentan un incremento de la permeabilidad de la membrana a la eosina y por lo tanto sus cabezas adquieren un color rosa en presencia del colorante permaneciendo con su color normal, blanco azulado, los espermatozoides vivos.-.-.-.Para resaltar los espermatozoides, opcionalmente (controles externos), se puede utilizar otro colorante, la nigrosina que tiñe el fondo de la preparación de púrpura (técnica de Williams Pollack).-.-.-.-.La vitalidad de los espermatozoides se puede determinar en fresco o en frotis teñido siendo la dilución de los colorantes utilizados: EOSINA al 0,5 g/l en suero fisiológico (solución de ClNa 9 g/l) y NIGROSINA al 1% (o 10%) en agua destilada. La observación se puede realizar con contraste de fases o campo claro.

Técnica de coloración en fresco (tinción supravital con eosina 0,5%):

Se realiza en los controles externos. 1º. Se coloca en un portaobjetos dos gotas de líquido seminal (10-15 μl) y se añade una gota de la solución de eosina. Homogeneizar con el borde del cubre. 2º. Se añade una gota de solución de nigrosina. Homogeneizar. 3º. Tapar con un cubre de 24×24 mm y dejar reposar 1 minuto. 4º. Observar con el objetivo de 40x con luz intensa o con contraste de fase. Contar el color de las cabezas (rojo-muertos, blanco/brillante-vivos) de 200 espermatozoides rápidamente, antes de que se produzca la desecación de la muestra. 5º. Se informa en porcentaje de espermatozoides vivos y muertos teniendo en cuenta que si el porcentaje de espermatozoides teñidos es el 30 % el índice de vitalidad es la inversa, es decir el 70 %.

Técnica mediante frotis teñido:

1º. En un tubo Eppendorf se coloca una gota de líquido seminal y dos gotas de solución de eosina (1% en agua destilada). Se mezcla y se espera treinta segundos. 2º. Se añaden tres gotas de la solución de nigrosina (10 % en agua destilada). Homogeneizar y esperar un minuto. 3º. Poner una gota de la mezcla de semen, eosina y nigrosina en un portaobjetos para microscopio y realizar una extensión (frotis fino) y dejar secar al aire. 4º. Se observa con objetivo de 40x o con el de inmersión. 5º. Se cuenta en 200 espermatozoides los que están teñidos y se dan los resultados en % de espermatozoides vivos y muertos y el índice de vitalidad.

Nueva Fórmula Manual Europeo:Disolver 0,67 g de Eosina Y en 100 ml de solución de ClNa 9 g/l, calentando suavemente. Añadir 10 gr de Nigrosina. Calentar hasta ebullición, dejar enfriar a temperatura ambiente y filtrar. Almacenar en botella de cristal cerrada herméticamente.

4.2.4 Fórmula espermática (espermiocitograma):

Durante la espermatogénesis se producen alteraciones en la formación de los espermatozoides originando formas ANORMALES que, si están en exceso, disminuyen la capacidad de fecundación del semen donde se encuentran.:-.-La valoración de estos espermatozoides anormales se realiza mediante RECUENTOS DIFERENCIALES EN EXTENSIONES TEÑIDAS.-.-..-El eyaculado siempre contiene células diferentes de los espermatozoides: células epiteliales del tracto uretral, células de la espermatogénesis -espermatides, espermatocitos y espermatogonias- y leucocitos.-.-.-.Estas células reciben el nombre genérico de CÉLULAS REDONDAS y, en general, no debe haber más de 5 × 10⁶ células redondas/ml y el número de leucocitos no exceder 1×10⁶/ml.

Defectos de cabeza :

• Formas grandes.
• Formas pequeñas.
• Alargadas (cociente largo/ancho >2).
• Forma de pera.
• Redondas.
• Amorfas.
• Vacuoladas (>20% del área de la cabeza ocupada por vacuolas no teñidas).
• Acrosomas pequeños (<40% del área de la cabeza).
• Dobles cabezas.
• Las cabezas de alfiler no se cuentan.
• Combinaciones de estos defectos.

Alteraciones en cuellos:

• Cuello doblado o acodado (cuando la cola y el cuerpo forman un ángulo de 90º con el eje longitudinal de la cabeza espermática).
• Inserción asimétrica, pieza intermedia ancha, irregular o estrecha o combinación de estas anormalidades.
• Cuello engrosado.
• Cuello adelgazado.

Alteraciones en la cola:

• Cola corta.
• Cola doble o múltiple.
• Horquilla.
• Rota/doblada (ángulo >90º).
• Irregular o enrrolladas.
• Combinaciones de estas anormalidades.
• Las colas sueltas no se cuentan.
• Una frecuencia alta de colas enrolladas puede indicar que el espermatozoide ha estado sometido a estrés hipoosmótico. También está relacionada con el envejecimiento del espermatozoide. Una frecuencia superior al 20% de formas enrolladas debe comentarse en el informe.

Gotas citoplasmáticas:

• Restos citoplasmáticos sobresaliendo en la base de la cabeza en el cuello/pieza intermedia.
• Las gotas con contorno liso y un tamaño no superior a la tercera parte de la cabeza del espermatozoide son clasificadas como normales.
• Si el tamaño de la gota es mayor o el contorno es irregular se trata de un residuo citoplasmático anormal y se clasifica como gota citoplasmática.
• Algunos espermatozoides inmaduros pueden tener gotas citoplasmáticas en otras posiciones a lo largo de la cola.

Defectos específicos:

Se han descrito defectos esterilizantes en los que prácticamente TODOS los espermatozoides producidos tienen un defecto estructural específico que perjudica a la función espermática como por ejemplo el defecto de cabeza redonda o globozoospermia.

Recuento morfológico diferencial:

1º. Extensión de la muestra. (2):Se coloca una gota de la muestra en un extremo del un porta limpiado con alcohol de 70 % y seco para evitar que la muestra se deslice fuera del porta (se pueden preparar antes y tener una caja de portas rotulada con OH). Se procede a realizar la extensión de forma semejante a la de un frotis sanguíneo -arrastrando una gota usando el borde de otro portaobjetos- pero procurando que no quede un frotis muy grueso. Si hay pocos espermatozoides se realiza una extensión gruesa.

2º. Fijación:Cubrir la extensión con alcohol metílico durante 5 minutos renovando el alcohol si es necesario y después se deja secar al aire o en estufa a 37ºC.

3º. Tinción:Pueden utilizarse varias tinciones: May Grümwald-Giemsa. Dick-Quick o Panóptico rápido (en el hospital La Plana). Hematoxilina-eosina. Papanicolau modificada. Tinción de Shorr. En el análisis de rutina se utiliza la primera por su sencillez y buena visualización morfológica de los espermatozoides aunque es la tinción de Papanicolau es la que ofrece un mejor detalle morfológico.-.-.-.Cubrir la extensión con la solución May Grümwald durante 4 minutos. Diluir con agua con un pH de 7,2 durante 4 minutos. Lavar con agua destilada (con suavidad). Cubrir con solución de Giemsa diluido -3 gotas de colorante por ml de agua con un pH 7,2-durante 12 minutos. Lavar con agua corriente suavemente. Secar al aire.

4º. Observar:Mediante microscopia de campo claro (sin contraste de fases) y objetivo de inmersión de 100x se cuentan 100 (preferiblemente 200) espermatozoides teniendo en cuenta que las cabezas aisladas se cuentan como anormales y las colas no se cuentan. Igualmente se cuantifican otras células como leucocitos, hematíes, células inmaduras procedentes de la espermiogénesis -no se cuentan como espermatozoides-, células epiteliales descamadas, células teratógenas… que en el examen en fresco no se diferenciaban. La OMS recomienda el uso de ocular con micrómetro.

5º. Informar:El informe se realizará con PORCENTAJES DE ESPERMATOZOIDES NORMALES Y ANORMALES, especificando en el último grupo la alteración morfológica. Igualmente se informará de la presencia de CÉLULAS INMADURAS (células redondas). Se expresan como formas inmaduras por 100 espermatozoides y puede calcularse su concentración en la muestra de semen a partir de la concentración de espermatozoides.-.-.-.Una aglutinación inferior al 10% es normal mientras que un aumento sugiere la presencia de anticuerpos en la superficie de los espermatozoides.___Un porcentaje de espermatozoides anormales entre el 30 y 40% es hipofecundante. Si supera el 40% se informa como TERATOSPERMIA y el semen es estéril. La presencia de más del 0,5 % de células epiteliales descamadas hace sospechar inflamación de uretra y/o próstata. Un incremento de los leucocitos superior a 1-2 por campo a 40x indica PIOSPERMIA e indica un proceso infeccioso de origen bacteriano al igual que la presencia de eritrocitos

4.3 Análisis bioquímico:

En el estudio bioquímico se avaluan componentes procedentes de les vesículas seminales, la próstata y los epidídimos.

Marcadores bioquímicos y localitzación:
Organo:	Próstata	Vesículas seminales
Parámetro bioquímico:	Ácido cítrico, Fosfatasa ácida, Zinc	Fructosa Carnitina. á-glucosidasa.

4.3.1. Marcadores prostáticos:

ÁC. CÍTRICO:Es representativo del funcionalismo prostático y su determinación es más simple que la de la Fosfatasa Ácida (violación).Los valores superiores provocan esclerosis del endotelio del túbulo seminífero por depósito de Ca.-.-.El déficit impide que el proceso de maduración de los espermatozoides sea adecuado y la motricidad de los espermatozoides será insuficiente.-.-.La determinación se puede hacer por ESPECTROFOTOMETRÍA.-.-.Valores normales: 250-800mg/dl.-..-

4.3.2. Marcadores de las vesículas seminales:

Fructosa: la glucosa que llega a través del torrente sanguineo a las vesículas seminales es transformada en fructosa y concentrada por el efecto de la testosterona.-.-. ¤Se encuentra disminuïda en los trastornos de las vesículas seminales o cuando falta la estimulación de la testosterona.-.-.La determinación es por ESPECTROFOTOMETRIA.-.-.Valores normales: 160-500mg/dl.

4.4 Análisis inmunológico:

La presencia de anticuerpos antiespermatozoides (AAE) en la secreción de la mujer es otra de las causas de infertilidad (40% de los casos de infertilidad inexplicada).-.-.Su origen puede ser femenino o masculino y actualmente es un ensayo obligado en cualquier seminograma básico.-.-.La producción de anticuerpos se inicia al entrar en contacto los espematozoides con el sistema inmune: Causas masculinas: traumatismo (vasectomía), reacciones inflamatorias, criptorquidia… Causas femeninas: ruptura epitelio.-.-.Los anticuerpos son Ig A (producidos por las células inmunológicas situadas en el tracto genital) e Ig G (por trasudación desde la sangre).-.-..Los efectos de la reacción antígeno(espermatozoide)-anticuerpo son: aglutinación, efecto citotóxico, dificultad de paso a través del moco cervical y la unión y penetración de la membrana pelúcida.-.-.-.La AGLUTINACIÓN de espermatozoides significa que los espermatozoides móviles se adhieren entre ellos (cabeza-cabeza, pieza intermedia-pieza intermedia, cola-cola u tras combinaciones).-.-.-.La adherencia de espermatozoides inmóviles o móviles con fragmentos de moco, con células que no son espermatozoides o con detritus (restos celulares, fibras mucosas), no se considera aglutinación sino AGREGACIÓN y agitando se disuelven.-.-.-.La incidencia en varones de parejas fértiles es del 2% y afecta entre el 5-20% de las parejas estériles de causa desconocida.-.-..-La presencia de aglutinación sugiere la existencia de una causa inmunológica de la infertilidad pero no es suficiente para justificarla.-.-.Si la analítica del semen sale normal y se considera necesario detectar anticuerpos unidos a la superficie del espermatozoide se realiza la prueba MAR; como marca comercial tenemos spermMAR®-

Procedimiento técnico para la detección de anticuerpos unidos a la superficie de los espermatozoides:

Si la analítica del semen sale normal y se considera necesario detectar anticuerpos unidos a la superficie del espermatozoide se realiza la prueba MAR; como marca comercial tenemos spermMAR®. (recomendado OMS 1999)-.-.Los anticuerpos antiespermatozoides son IgA o IgG; los anticuerpos IgA necesitan la presencia de IgG simultáneamente por lo que, de forma rutinaria, es suficiente la determinación de IgG. Los anticuerpos Ig M, por su alto peso molecular, rara vez aparecen en el semen.

Técnica:

Se deposita en sobre un porta 10 μl de semen homogeneizado, 10 μl de partículas de látex revestidas de IgG humana (frasco tapón blanco) y mezclar la muestra y el reactivo 5 veces con el borde del cubreobjetos. Mezclar 10 μl de antisuero anti IgG humana (frasco tapón azul) y colocar un cubreobjetos de 24 × 24 mm. Observar a microscopio óptico 40x. Leer a los 2 minutos y repetir la lectura a los 10 minutos. La formación de aglutinados mixtos entre las partículas de latex y espermatozoides móviles demuestra la presencia de anticuerpos IgG en los espermatozoides. Se deben contar no menos de 100 espermatozoides con motilidad progresiva. Se informa como porcentaje de espermatozoides móviles que tiene adheridos anticuerpos a su superficie y el patrón que presenta (cabeza y/o cola).-.-.-.Se informa como porcentaje de espermatozoides móviles que tiene adheridos anticuerpos a su superficie y el patrón que presenta (cabeza y/o cola).-.-.-.El diagnóstico de infertilidad inmunológica es probable cuando el 50 % o más de los espermatozoides móviles tienen partículas adheridas. Se sospecha infertilidad inmunológica cuando del 10 al 50% de los espermatozoides móviles tiene partículas adheridas.-.-.Un alto contenido de moco interfiere en los resultados de la prueba.

6. ANALISIS POST-VASECTOMIA:

El estudio post-vasectomia debe ser preferentemente realizado antes de 4 horas desde la obtención de la muestra.-.-.La muestra puede conservarse a temperatura ambiente o 37º C y no debe someterse a temperaturas extremas (= 20º C o =40º C).

TÉCNICA:

1.Se homogeniza la muestra y con una pipeta se depositan 10μl sobre un porta colocando un cubreobjetos de 22 x 22 mm. 2. Se observa la muestra con microscopio por contraste de fases (por defecto, campo claro) con objetivo de 40x. 3. Si aparecen espermatozoides se informa la CANTIDAD (abundantes, frecuentes…) y la MOVILIDAD (% de movilidad) y se informa como ECO3 Remitir nueva muestra dentro de un mes para proseguir estudio. 4. Si en la muestra NO SE OBSERVAN ESPERMATOZOIDES EN FRESCO POR PRIMERA VEZ, se centrifuga la totalidad del semen en un tubo de Kova a 3.000 rpm durante 10 minutos; se elimina el sobrenadante con una pipeta hasta que quede un volumen máximo de plasma seminal de 100 μl en el que se resuspende el botón del fondo mediante una pipeta. 5. Se deposita una gota del semen centrifugado en un porta con un cubreobjetos y se mira al microscopio por contraste de fases. 6. Si la muestra es + (no hay espermatozoides), se informa ECO1 primera muestra recibida, remitir nueva muestra dentro de un mes para concluir o proseguir estudio. 7. Si es la segunda muestra CONSECUTIVA sin presencia de espermatozoides reinforma ECO2 segunda muestra consecutiva negativa: Azoospermia y se da por finalizado el estudio.-.-.-Se informa ALTA tras dos azoospermias consecutivas con 2-4 semanas de intervalo antes de suspender la anticoncepción preventiva tras vasectomía.-..-Si la muestra es – (hay espermatozoides), se informa como ECO3: remitir nueva muestra dentro de un mes para proseguir estudio.

TEMA: ANÁLISIS DEL LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO:

1. INTRODUCCIÓN:

El líquido cefalorraquídeo es un líquido acuoso que se forma principalmente en los plexos coroideos – ovillos capilares con una cubierta epitelial- situados en el techo de los ventrículos cerebrales mediante una combinación de transporte activo y ultrafiltración junto a una difusión pasiva de agua para mantener el equilibrio osmótico.-.-.-.-.Una vez formado rellena los ventrículos cerebrales y pasa a través de los agujeros de Lushka y Magendie hasta el espacio subaracnoideo circulando sobre los hemisferios cerebrales, alrededor de la médula espinal y canal medular central así como rodeando los nervios raquídeos.___—____.

Las meninges son las membranas de tejido conectivo que cubren todo el sistema nervioso central.-.-.-.Las 3 meninges son duramadre, aracnoides y piamadre.-.-Los espacios que delimitan son: el EPIDURAL (entre el estuche osteoligamentoso – cráneo o raquis- y la duramadre), el SUBDURAL (entre la duramadre y la aracnoides) y el SUBARACNOIDEO (entre las dos hojas de la aracnoides).-.-.El espacio epidural es aprovechado en la médula para inyectar anestésicos locales consiguiendo anestesia temporal del abdomen y miembros inferiores.-.-.-.La composición del líquido cefalorraquídeo es agua, sales minerales, glucosa y proteínas de bajo peso molecular.-.-.Por término medio el volumen de LCR en el ser humano adulto es de 130 mL renovándose más de tres veces al día.-.-.-.

Las funciones del LCR son:

• Amortiguador hidráulico (compensa los cambios de volumen de sangre intracraneal).
• Soporte mecánico del cerebro (mantiene flotante el encéfalo).
• Vehículo para el transporte de nutrientes y eliminación de productos de desecho del metabolismo cerebral.
• Transporte de mensajeros químicos.
• Mantenimiento del equilibrio bioquímico cerebral.-.-.-.-.

El interés clínico del estudio del LCR se debe a las variaciones que sufre su composición en determinadas patologías: Sospecha de meningitis, encefalitis, hipertensión craneal, abceso cerebral, hemorragia subaracnoidea, esclerosis múltiple, leucemias relacionadas con el SNC, etc. Diagnóstico diferencial entre infarto y hemorragia cerebral.

2. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA:

El LCR se obtiene, generalmente, mediante PUNCIÓN LUMBAR del espacio subaracnoideo situado entre las vértebras lumbares 3 y 4 para evitar lesionar la médula espinal.-.-.El paciente se coloca en DECÚBITO LATERAL, con las rodillas pegadas al pecho y el cuello flexionado de modo que queden abiertos los espacios intervertebrales..-.-.-.-Por regla general se recogen de 2,5 a 5 ml si la presión a la que sale el LCR es normal -entre 50 y 180 mm H₂O en decúbito- aunque pueden obtenerse desde unos pocos ml en un niño a 10-20 ml en un adulto.-___—___El LCR debe ser recogido de forma secuencial en tres tubos de ensayo estériles que se numerarán en orden de extracción y se destinarán: el primero para estudios bioquímicos e inmunológicos; el segundo para microbiología y el tercero para estudios citológicos.___—__El tubo destinado a estudios citológicos debe contener una gota de heparina para evitar la formación de agregados celulares. El tubo utilizado para determinaciones bioquímicas es conveniente que contenga fluoruro sódico para disminuir el efecto de la glucólisis.-.-.-.Las principales complicaciones que presenta la punción lumbar son las siguientes: Enclavamiento del cerebelo o las amígdalas. Meningitis, en caso de que exista sepsis, al perforar las meninges. Hematoma subdural o extradural si el paciente tiene algún transtorno de la coagulación o toma fármacos anticoagulantes. Infección iatrogénica debida a la punción por existencia de una infección cutánea en la zona lumbar. Las muestras deben ser enviadas rápidamente al laboratorio para su procesamiento inmediato. Se mantendrán a bajas temperaturas las destinadas a análisis bioquímicos y citológicos y a 37ºC la destinada a realizar cultivos.

4. ANÁLISIS DE RUTINA:

4.1 ANÁLISIS FÍSICO: ASPECTO Y COLOR:

El LCR, en condiciones normales, presenta un aspecto transparente y cristalino con una viscosidad semejante a la del agua por lo que se le compara al agua de roca.-.-Es patológica la aparición de turbidez, opalescencia o aspecto rojizo, xantocrómico o amarillento.-.-La TURBIDEZ se clasifica en una escala de 0 a 4 +.¨La turbidez puede ser causada por: la existencia de una concentración de leucocitos = 200μl, una concentración de eritocitos = 400μl, por la presencia de microorganismos o una concentración de proteínas elevada.-.-.El COLOR normal es CLARO, TRANSPARENTE con aspecto de agua de roca.-.-.Cuando el LCR es de color rojizo, hemático o hemorrágico, sugiere la presencia de sangre que puede ser resultado de: una punción traumática o de una hemorragia subaracnoidea, intracerebral o de un traumatismo.-.-..-