La manipulación de muestras biológicas potencialmente infecciosas expone a los técnicos a riesgos. No todos los microorganismos que se manipulan en el laboratorio son infecciosos. Los virus, bacterias y hongos, entre otros agentes infecciosos, pueden ser causantes de enfermedades, por lo que pueden originar riesgos para las personas que los manejan. Para que se produzca una enfermedad infecciosa en el laboratorio tienen que concurrir una serie de circunstancias como:

• En el microorganismo: Número suficiente de microorganismos. Virulencia adecuada.
• En el individuo: Susceptibilidad del individuo. Vía de entrada. Desarrollo del microorganismo.
• En el desarrollo de la técnica: Manipulación inadecuada de microorganismos. Mala limpieza y desinfección del material.

Para minimizar los riesgos, lo primero que habrá que hacer es identificarlos y evaluarlos; después se elaboran normas de prevención y protocolos de actuación frente a casos de accidente. Las normas de seguridad estarán enfocadas a lograr que el trabajo se realice con un riesgo mínimo para los técnicos y el resto del personal, para los ciudadanos en general, y para todos los seres vivos que los rodean y el medio ambiente. Con respecto a las normas preventivas de seguridad, existen normas básicas que sí pueden ser extrapolables a la mayoría de los laboratorios. Sin embargo, cada laboratorio debe establecer sus propias normas de obligado cumplimiento, siempre teniendo como referencia la normativa europea y nacional. El plan de prevención y seguridad debe ser conocido y respetado por todos los trabajadores. Algunos conceptos significativos de seguridad biológica que se deben conocer son:

Conceptos Clave en Seguridad Biológica

• Biopeligrosidad: Cualidad potencial de algunos agentes biológicos, sustancias y materiales que los contienen, para desarrollar enfermedades en humanos, animales o plantas.
• Microorganismo: Entidad microbiológica, celular o no celular, con capacidad para reproducirse o transferir material genético, pudiendo desarrollar o no desarrollar enfermedad.
• Agentes biológicos: Son microorganismos, incluidos los modificados genéticamente, cultivos celulares y endoparásitos humanos capaces de causar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad. Se considera agentes biológicos a ciertos genes o especies de bacterias, Rickettsias, Chlamydias, virus, hongos, parásitos, cultivos celulares, viroides, priones y cualquier otro agente infeccioso que se contemple en leyes y normativas.
• Símbolo de biopeligrosidad: Cualquier icono que debe figurar en el acceso a todos los laboratorios de contención, así como en cualquier recipiente que contenga material biológico potencialmente infeccioso.
• Vía de infección: Mecanismo por el cual el agente biológico penetra en el organismo humano en número suficiente y se replica, pudiendo afectar a la salud, que sufrirá la infección, lo que a su vez provocará una respuesta evidente y variable por parte del individuo. Los síntomas están relacionados con la gravedad de la infección. Las vías de infección más habituales en el laboratorio son:
  • Digestiva: Por vía oral, al llevarse las manos u objetos a la boca o bien al aspirar las pipetas directamente con la boca.
  • Parenteral: A través de la piel, al producirse heridas o abrasiones con objetos punzantes o cortantes.
  • Cutáneas: Especialmente por vía ocular, debido a salpicaduras o por tocarse los ojos con las manos.
  • Respiratoria: Al inhalar microorganismos en la formación de aerosoles.

Clasificación de Agentes Biológicos: Grupos de Riesgo

En función de su patogenicidad, los agentes biológicos son clasificados por la OMS en 4 grupos de riesgo en orden creciente de peligrosidad. También asumen esta clasificación las normativas europea y española. Los grupos de riesgo de los agentes biológicos son:

Grupos de Riesgo de los Agentes Biológicos

• Grupo 1: Agentes biológicos con bajo riesgo para el individuo y para la colectividad. No se asocian con enfermedades en humanos o animales adultos sanos. Se incluyen la flora habitual y microorganismos como la cepa no patógena de E. Coli K12 y el hongo de la levadura de cerveza y del pan.
• Grupo 2: Agentes biológicos que pueden causar enfermedades en el ser humano, suponiendo un riesgo, pero con poca probabilidad de que se propague a la colectividad, es decir, no suelen dar lugar a epidemias. Se asocian a enfermedades en humanos y animales generalmente leves para las que se dispone de medidas de tratamiento y prevención eficaces. Se incluyen la mayoría de bacterias (Actynomices sp, Bordetella pertussis, Clostridium botulinum, Enterobacter…), también parásitos (Entamoeba histolytica), hongos (Aspergillus) y virus (Citomegalovirus).
• Grupo 3: Son agentes biológicos que pueden causar graves enfermedades en el ser humano y provocar epidemias porque existe la probabilidad de que se propaguen a la colectividad. Están asociados a enfermedades humanas graves para las que generalmente existen medidas de profilaxis o tratamiento que limitan la propagación de la enfermedad. Bacillus anthracis, Brucella, Mycobacterium tuberculosis, Shigella… Parásitos, hongos y virus (VIH, VHB).
• Grupo 4: Se trata de agentes biológicos con alto riesgo para el individuo y la comunidad. Se asocian a enfermedades humanas graves con altas probabilidades de provocar epidemias y sin que existan, generalmente, medidas preventivas o terapéuticas que limiten la propagación de la enfermedad. En todos los casos es necesario el uso de cabinas de seguridad y filtración de aire. No hay incluido ningún parásito, bacteria u hongo, pero sí hay virus. Ejemplos: virus Ébola, el de la fiebre hemorrágica de Crimea/Congo.

Niveles de Bioseguridad

En correspondencia con el grupo de riesgo se establecen los correspondientes niveles de bioseguridad. Al igual que los agentes biológicos se clasifican en 4 grupos, también existen 4 niveles de contención biológica, 1 por grupo, de modo que hay un nivel 1 que afecta a agentes del grupo 1, un nivel de contención 2 para agentes del grupo 2 y niveles de contención 3 y 4 para agentes biológicos de los grupos 3 y 4, respectivamente. Cada uno de estos niveles pretende establecer métodos de trabajo seguro que eviten o reduzcan al mínimo el peligro biológico por exposición cotidiana del personal del laboratorio y de otros trabajadores. Estos niveles son el resultado de combinar protocolos de técnicas seguras microbiológicas e inmunológicas, con barreras primarias (equipos de protección y aparatos de seguridad) que protegen al personal y al ambiente de trabajo del laboratorio y barreras secundarias como el establecimiento de zonas, el control del flujo de corrientes de aire, el filtrado de salida del aire al exterior, las técnicas de descontaminación (desinfección y esterilización), la eliminación de residuos y otras que protegen al ambiente exterior del laboratorio. La bioseguridad de un laboratorio ha de estar organizada, cumpliendo ciertos requisitos:

Requisitos de Bioseguridad en el Laboratorio

• Identificar y evaluar los riesgos: Se utilizará toda la información y conocimientos disponibles y se determinará su naturaleza, el grado y duración de la exposición. Se deben adoptar las recomendaciones de expertos.
• Minimizar riesgos: Se reducirá el riesgo de exposición al mínimo posible, adoptando medidas adecuadas, para garantizar la seguridad. Cabe destacar:
  • Medidas técnicas de disposición del laboratorio.
  • Medidas higiénicas referidas a hábitos personales, normas de trabajo o procedimientos de trabajo y manipulación.
  • Medidas sanitarias. Reconocimientos médicos.
  • Formación continuada de los trabajadores.

Cabinas de Seguridad Biológica (CSB)

Al manipular muestras biológicas existe la posibilidad de que se formen aerosoles en la atmósfera del laboratorio, con el peligro de inhalación por parte del personal del mismo. Si el agente biológico es especialmente infeccioso, puede suponer un grave riesgo no sólo para los que lo manipulan, sino también para las personas ajenas y otros seres vivos. Con el fin de reducir los riesgos biológicos se emplean sistemas de ventilación que producen una presión negativa respecto a la presión atmosférica en el habitáculo del laboratorio, o bien se utilizan cabinas de seguridad. Éstas se subdividen en campanas extractoras de gases, cabinas de flujo laminar y cabinas de seguridad biológica. Las CSB se utilizan en procedimientos que pueden originar aerosoles biopeligrosos. Estas cabinas protegen al trabajador y al ambiente del riesgo que se sufre al manipular material biológico.

Hay de varias clases, dependiendo del grado de seguridad que se quiera conseguir:

Tipos de Cabinas de Seguridad Biológica

• CSB de clase 1: Vitrina abierta al espacio del laboratorio, y un dispositivo de extracción de aire a través de un filtro que retiene las partículas que pudieran haber. El aire, antes de devolverlo a la atmósfera, pasa por un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air), que garantiza una eficacia mínima del 99,99% en partículas de 0,3 micrómetros de diámetro.
• CSB de clase II: Son básicamente como las de tipo I, pero diseñadas para evitar tanto la contaminación de trabajadores y ambiente, como para proteger a los materiales y muestras que se manipulan. Filtran tanto el aire de entrada como de salida.
• CSB de clase III: Son las más seguras. El ambiente de la cabina está separado completamente del manipulador a través de mamparas de vidrio, accediendo a ella a través de guantes de goma que van incluidos en la cabina. El ambiente que respira el manipulador es distinto al de la cabina.

Normas de Trabajo y de Seguridad

Las normas básicas que hay que tener en cuenta se pueden resumir en dos: garantizar la seguridad del técnico y su entorno y garantizar la integridad del material objeto de estudio. Es importante el estricto cumplimiento de los siguientes aspectos fundamentales:

Aspectos Fundamentales de Seguridad

• Respetar escrupulosamente los protocolos de trabajo del laboratorio.
• Utilizar adecuadamente los equipos y realizar periódicamente la descontaminación.
• Adoptar en todo momento las debidas precauciones, ya que muchas veces es imposible saber a priori si el germen a investigar está incluido en el grupo 2 ó 3.
• Mejorar la formación en temas de seguridad biológica.
• Seguir los protocolos establecidos en casos de emergencia.

Normas de Protección Relacionadas con la Higiene Personal

• No se debe comer, beber, fumar, mascar chicle, tomar caramelos, ni peinarse o aplicarse cosméticos en el laboratorio.
• El cabello largo tiene que estar recogido.
• No se puede utilizar el frigorífico del laboratorio para guardar alimentos o bebidas.
• Las lentillas de contacto ocular sólo se utilizarán cuando no se puedan utilizar otro tipo de lentes. En general, nunca se deben usar cuando se trabaja con agentes biológicos, y por supuesto no se pueden poner o aplicar en el laboratorio.
• La ropa y efectos personales se dejarán en los lugares dispuestos para ello, fuera del laboratorio.
• Las pulseras y colgantes deben evitarse, sobre todo si son holgadas porque pueden interferir en la manipulación y técnica de trabajo (derrames, contaminación).
• Cuando se acude a trabajar con heridas o cortes en las manos hay que comunicarlo al responsable del laboratorio, proteger la lesión con una gasa y ponerse en todo momento guantes desechables.
• Hay que lavarse las manos con jabón antiséptico, no sólo antes de entrar y abandonar el laboratorio, sino también cada vez que se manchen con algún producto biológico, o se desechen los guantes.

Normas de Protección Relacionadas con la Metodología de Trabajo

• Hay que utilizar siempre bata blanca cerrada, de manga larga y limpia.
• No se deben emplear los bolsillos de la bata de laboratorio para llevar tubos o productos.
• Las gafas de seguridad son obligatorias cuando haya riesgo de salpicaduras.
• Nunca se pipeteará con la boca, sino que se usarán prepipetas.
• Si se contempla la manipulación de microorganismos patógenos, deben usarse necesariamente guantes desechables.
• Se emplearán gradillas y soportes adecuados.
• El laboratorio debe estar ordenado y limpio. Sólo permanecerá en el área de trabajo el material imprescindible.
• Debe reducirse al máximo la formación de aerosoles.
• El material empleado en la manipulación de microorganismos ha de ser estéril.
• Las manipulaciones que realice el técnico, garantizarán la no contaminación de la muestra objeto de estudio y de los materiales.
• El material empleado que haya estado en contacto con material potencialmente infeccioso deberá ser acondicionado para evitar la diseminación de los microorganismos. Para ello se utilizarán contenedores adecuados, etiquetados con el anagrama de riesgo biológico, para proceder posteriormente a su descontaminación.
• Las superficies de trabajo tienen que descontaminarse adecuadamente al finalizar el trabajo o tras un derrame accidental.
• Ante la duda de que un material esté contaminado, se considerará que sí lo está y se procederá a su descontaminación.
• Al finalizar una tarea se debe recoger todo el material, dejándolo en condiciones de poder ser utilizado posteriormente. Toda el área utilizada ha de quedar en perfecto estado de orden y limpieza.
• En el laboratorio no se trabajará nunca solo.
• Las incidencias, como accidentes o roturas de material, se comunicarán inmediatamente al responsable del laboratorio.

Normas de Protección Relacionadas con el Entorno del Laboratorio

Hay que evitar que la comunidad ajena al laboratorio se vea afectada por los posibles riesgos biológicos, para ello se deben establecer barreras que impidan el paso de los microorganismos al exterior.

• Nunca se permanecerá fuera del laboratorio con la bata.
• No se sacará fuera del laboratorio ningún material potencialmente infeccioso.
• El acceso de personas al laboratorio debe ser restringido.
• El material contaminado debe ser esterilizado en el autoclave antes de reutilizarse o desecharse.

Preparación del Material para Microbiología

Es necesario guardar unas normas de conducta que puedan evitar el riesgo permanente que existe en el laboratorio de bacteriología alimentaria respecto a:

• La contaminación por posibles bacterias patógenas, que supone un peligro, directo o indirecto, para las personas que trabajan en el laboratorio.
• La contaminación de los medios de cultivo, material de laboratorio, ambiente, etc. con gérmenes procedentes del exterior, cuyo desarrollo supone una mala manipulación que contribuiría a dar resultados erróneos.

En la preparación del material para microbiología hay que tener en cuenta los siguientes aspectos:

• El material que va a estar en contacto directo con microorganismos tiene que estar estéril, puesto que si no, añadimos gérmenes distintos a los que se pretenden analizar.
• Perfecta limpieza del material previa a la esterilización porque la suciedad impide la esterilización correcta y pueden quedar restos de sustancias químicas.
• La expansión de microorganismos en gran cantidad y/o en lugares no deseados (contaminación), es causa de errores y peligro para nuestra salud.
• Una limpieza global del laboratorio con desinfecciones periódicas disminuye la cantidad de microorganismos del ambiente y, por tanto, los índices de contaminación.

Por todo ello, manipularemos el material de la forma más adecuada.

Tras la utilización del material, si es desechable, se descontamina y elimina por incineración. Si no es desechable, se descontamina y se procede a su recuperación mediante limpieza y preparación para su uso posterior.

Fases de la Manipulación del Material

Descontaminación

Eliminación de todos los microorganismos patógenos que se encuentran en el material utilizado en el estudio de una muestra antes de su manejo. Lo ideal es utilizar material desechable o de un solo uso, pero esto es caro, por lo que muchas veces hay que utilizar material que se pueda recuperar limpiándolo y esterilizándolo perfectamente. Las técnicas que nos sirven para la descontaminación son:

• Desinfección: Eliminación de microorganismos patógenos.
• Esterilización: Destrucción de todo agente microbiológico contenido en un producto, tanto si está en forma vegetativa como en forma de resistencia.

Técnicas de Descontaminación

1. Incineración: Se utiliza para descontaminar y eliminar a la vez material desechable inflamable. Si el incinerador está fuera del laboratorio, se descontaminaría el material por otro método antes de su transporte.
2. Autoclave: Descontamina material tanto desechable como recuperable, colocándose en bolsas de plástico especiales (resistentes al calor) o en recipientes metálicos que recojan los restos de medios de cultivo. Se utiliza igual que para esterilizar.
3. Desinfectantes químicos: Se emplean para descontaminar materiales que se estropearían con el calor o bien cuando va a transcurrir cierto tiempo entre la utilización de dicho material y los procesos anteriores de descontaminación. Se suele usar lejía, formol, etc. durante varias horas.

Limpieza

Eliminación de suciedad por sustancias jabonosas, facilitando el arrastre por acción mecánica de cepillos, estropajos, escobillones, etc. Aclarar con agua abundante y al final con agua destilada. Escurrir y se seca a temperatura ambiente o en estufa.

Si hay suciedad persistente se deja el material en mezcla sulfocrómica y después se realizan los pasos anteriores.

Técnicas Específicas de Descontaminación y Limpieza

• Pipetas: Tras la descontaminación por inmersión en desinfectante se realiza su limpieza.
• Material que contenga medios de cultivo: Pueden ser tubos, placas de Petri, matraces, etc. Se descontaminan en el autoclave y después se limpia o se elimina el desechable (placas de Petri).
• Portaobjetos y cubreobjetos: Tras su uso se descontaminan por inmersión en desinfectante, se limpian y tras el aclarado se introducen en alcohol etílico para desengrasarlos y a continuación se pasan por agua destilada. Se secan con un paño de algodón que no deje hilo.
• Papel de filtro: Establece una barrera entre la mesa de trabajo y el material cuando está seca. Si se moja hay que desecharlo, al igual que tras un cambio de trabajo, y al final de la jornada.
• Mecheros: Se utilizan para esterilizar por flameado las asas de siembra, puntas de pipetas, bocas de matraces y tubos de ensayo, etc. Hay que mantenerlos en buen estado.
• Asa o hilo de siembra: Se esterilizan inmediatamente antes y después de su uso, por flameado a la llama del mechero, hasta llegar al rojo vivo en posición lo más vertical posible. Eliminar periódicamente los restos calcinados y limpiar los mangos.
• Derrame accidental sobre superficie: Se debe cubrir con un trapo empapado en desinfectante químico, durante 30 minutos. Posteriormente se recogerá el derrame con el trapo y se colocará éste en un contenedor para residuos contaminados o bien en una bolsa de autoclave para su esterilización. Como desinfectante químico vamos a utilizar hipoclorito sódico a una concentración de 1 g/litro de cloro libre. En los casos que pueda haber concentraciones elevadas de microorganismos se empleará una concentración de 10 g de cloro libre. La lejía comercial doméstica se emplea diluyéndola en una proporción 1:8.

Conservación del Material

Preparación del Material para Esterilizar

Una vez que el material está químicamente limpio hay que mantenerlo estéril desde el momento de la esterilización hasta el momento de su utilización e incluso protegerlo durante el proceso esterilizador. Se procede a envolverlo de tal forma que pueda penetrar el medio esterilizante, pero no los microorganismos después de la esterilización, contaminándolo. Los envoltorios utilizados son diferentes según el método de esterilización adoptado:

• Papel poco poroso no inflamable: para horno de calor seco (esteriliza en profundidad).
• Papel de porosidad suficiente para el vapor de agua, pero no para los microorganismos. Utilizado en el autoclave.
• Cajas metálicas: Tanto para hornos como para autoclave.
• Papel de aluminio: No es poroso y se puede utilizar en hornos de calor seco.
• Papel para la esterilización por óxido de etileno, cuyo tamaño de poro está calibrado para que penetre sólo el gas esterilizante.

En general, hay que proteger todas las superficies que están en contacto con los microorganismos. Se utilizan preferentemente hornos de calor seco, pues el autoclave tiene el inconveniente de dejar mojado el material y el óxido de etileno no se emplea normalmente en microbiología.

Técnicas Especiales

• Pipetas: Se envuelven de una en una o en grupos en papel crepé, manila o semejante.
• Tubos de ensayo: Se cierran con tapones de algodón graso, de aluminio o de baquelita.
• Material con boca estrecha: Se tapan las bocas con algodón o papel.
• Material irregular o con varios orificios: Se envuelven totalmente.

Desinfección

Técnica cuyo fin es la destrucción de gérmenes patógenos y la mayoría de saprofitos.

Métodos Físicos

• Calor: Por ebullición, no es útil a gran escala porque no se eliminan esporulados ni el virus de la Hepatitis A. Inconvenientes: elevado gasto energético que produce. No garantiza la eliminación total de microorganismos. No posee acción residual.
• Ultrasonidos: En segundos ejercen elevado poder bactericida. Inconvenientes: elevado coste y además no tiene efecto residual.
• Irradiación ultravioleta: Se emplean radiaciones de longitud de onda igual a 254 nm y lámpara de mercurio. Como inconvenientes: Elevado coste; requiere que no exista color ni turbidez; no tiene acción residual. Su uso es para pequeños abastecimientos.

Métodos Químicos

• Tensioactivos catiónicos: Sales de amonio cuaternario. Elevado poder germicida. Algicidas en piscinas.
• Halógenos:
  • Bromo: Se usa en piscinas.
  • Yodo: Se utiliza en grandes concentraciones. Mayor tiempo de contacto. Activo frente a quistes y virus.
  • Cloro: El más utilizado. El cloro y sus derivados es el que mejor cumple los requisitos de un buen desinfectante.
  • Ozono: Se le considera un oxidante poderoso. Reduce el color, sabor y fenoles. Tiene elevado poder desinfectante. Inconveniente: elevado coste de las instalaciones y además es difícil controlar su concentración.

Esterilización

Técnica que tiene como fin la destrucción de cualquier forma de vida: gérmenes patógenos, saprofitos e incluso las formas de resistencia (esporas).

Métodos Físicos

• Calor seco:
  • Flameado: Consiste en pasar el material por la llama del mechero. Se utiliza para el asa de platino, boca de tubos, boca de matraces.
  • Incineración: Destrucción total por calor. Cada vez se utiliza menos por el uso de material desechable.
  • Horno Pasteur o Poupinel: 180 ºC durante 50 minutos. 160 ºC durante 130 minutos. Por este método no se puede esterilizar el material de goma. Para esterilizar pipetas y algún otro material de vidrio principalmente.
• Calor húmedo: Autoclave: Método que utiliza vapor de agua a presión determinada. El vapor de agua se difunde por ósmosis en el interior de la membrana celular y de las esporas coagulándose su protoplasma. Método ideal en bacteriología. Se compone de un cuerpo cilíndrico con una placa metálica perforada que separa la parte reservada al agua. Posee una tapa que se ajusta y cierra herméticamente. Consta de un manómetro cuya misión es indicar la presión interior; de un termómetro que indica la temperatura alcanzada y un cronómetro que indica el tiempo. Existe una relación directa entre la temperatura y la presión de esterilización. A más temperatura, más presión alcanzada: 120-1, 123-1,2, 125-1,4, 128-1,6, 130-1,8, 133-2.
  

  Control de Esterilización

  Para comprobar que el proceso de esterilización se ha realizado correctamente existen controles:

  1. Físicos: Consisten en unos registros de control de temperatura y tiempo. Estos registros se pueden leer en unas hojas.
  2. Químicos: Se trata de pinturas donde termosensibles que cambian de color según la temperatura.
  3. Bacteriológicos (esporas): Se coloca un cultivo de esporas. Después de finalizada la esterilización se observa si éstas crecen, en caso positivo la esterilización no se ha realizado correctamente.
• Filtración: Líquidos que no pueden esterilizarse por acción del calor, se esterilizan mediante filtrado. Para ello, se emplean filtros cuyos poros son del tamaño al que suelen tener los microorganismos (Ejemplo: filtro Millipore). Debido al pequeño tamaño de los poros, el proceso debe hacerse a presión.
• Radiaciones

Métodos Químicos

• Óxido de etileno: Se utiliza fundamentalmente para el material de goma y corte. Al tratarse de un gas tóxico, el material una vez esterilizado debe ser aireado en condiciones asépticas.