Siembra y Cultivo

El paso de la muestra a un medio de cultivo se denomina siembra o inoculación (en medio líquido). El paso de bacterias de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra. Tras diversos pasos se consigue obtener en un medio de cultivo una sola especie bacteriana, obteniéndose así lo que se llama cultivo puro o axénico. Las operaciones tales como toma de muestra, siembras, resiembras, inoculación, aislamientos… se debe hacer de manera que se evite toda contaminación (ambiente estéril) trabajando bajo la llama de un mechero o en el interior de cámaras estériles.

Material de Siembra

– Asa de siembra: Es utilizada para la inoculación o siembra por estría en medios sólidos, por picadura en medios sólidos y semisólidos y para la siembra de medios líquidos. También son llamadas asas de platino y las más utilizadas son las de 0,01 ml que se esterilizan por flameado.

– Hilo de platino: Alambre recto fijado a un mango que se utiliza para transferir colonias de una placa a otra en medios sólidos y semisólidos por picadura.

– Asas de Drigralsky: Son asas de vidrio con forma de triángulo que sirve para extender el inóculo líquido.

– Hisopos: Se utilizan para la toma de muestras e incluso de transporte ya que ahora llevan incorporados un medio para que la muestra no sufra daño de ningún tipo.

– Pipetas: Son muy utilizadas en bacteriología para la inoculación de muestras líquidas o transferencia de cultivos líquidos.

Método de Siembra- Inoculación

El paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo se denomina siembra o inoculación. El paso de una muestra de un medio a otro se denomina resiembra. Tipos: En medio líquido: Desde muestra sólida–>asa. Desde muestra líquida–>asa–>Pipeta–>Hisopo. En medio sólido: Desde muestra sólida–>en placa–>asa–>en tubo. Desde muestra líquida–>asa–>Asa Driglasky–>hisopo

) Siembra del Inóculo en Medio Líquido:

Con asa de siembra se adiciona al medio agitándola. Con pipeta se vierte agitándose hasta su homogeneización. Con hisopo o escobillón igual que con el asa de siembra.

) Siembra de Inóculo en Medio Sólido:

a. Siembra de inóculo en placa. Técnica de Barry: Para ello en el medio de cultivo previamente fundido en tubo se le añade el inóculo, se homogeneiza, se vierte en la placa Petri y se deja solidificar. Se utiliza para la determinación de CMI. Siembra de muestra líquida en placa con asa de Driglasky: Consiste en distribuir la muestra de manera uniforme por la superficie del medio de cultivo contenido en la placa. Para ello adicionamos al medio sólido un inóculo líquido con la pipeta graduada, y posteriormente se extiende con el asa de Driglasky: Se utiliza para el recuento de viables y antibiogramas. Siembra por agotamiento: Aislamiento en estrias simples. Se tomará con el asa de siembra una cantidad adecuada depositando el inóculo en uno de los extremos superiores de la placa, se realizarán movimientos en zig-zag sin levantar el asa hasta concluir la siembra en toda la placa. Siembra por agotamiento: Aislamiento por estría múltiple. Se toma el inóculo y se deposita en el extremo superior, extendiéndose en la parte superior solamente. Flameamos y giramos ligeramente la placa continuando con el proceso anterior. Repetimos la operación 4 o 5 veces. El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que cada vez se van arrastrando y separando más la muestra. Técnica de los cuatro cuadrantes: Con un rotulador dividimos la placa en 4 cuadrantes iguales. Con el asa extendemos por cada cuadrante el inóculo haciendo zig-zag sin flamear. Finalmente observaremos como en el último cuadrante las colonias se encuentran aisladas o separadas. Técnica de los 3 giros: Se rotula la placa de forma análoga con el asa de platino y se siembra por estría la mitad superior de la placa. Flameando giramos 90º y volvemos a sembrar (así hasta 3 veces). Esta técnica no es muy utilizada. Técnica de siembra por dilución: Se dispondrá de una batería de tubos y se adicionará una cantidad de muestra conocida en el primer tubo, homogeneizamos diluimos en los siguientes tubos hasta obtener la dilución deseada. Una vez realizada la dilución (ej. 10-3 y 10-4) inoculamos en placas de cultivo y extendemos con el asa de Drigralsky. Incubamos a la temperatura precisa durante 24 horas y recontamos.

b. Siembra del Inóculo en Tubo

Siembra por estría en tubos con medio sólido inclinado: Con el asa de siembra se añade al tubo una cantidad de muestra realizando movimientos ascendentes en zig-zag. Este método es utilizado para conservar cepas durante largos periodos, así como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas. Siembra por picadura: Con un hilo de siembra introducir el asa en el medio de cultivo hasta el fondo sin tocar el mango al tubo y en la zona central de este. Se utiliza en la siembra de cultivos semisólidos, para observar la movilidad del m.o. Siembra con picadura y estrías: Se realiza primero la picadura y luego las estrías igual que en las dos técnicas anteriores. Las dos con el hilo.

Introducción al Análisis Microbiológico: Diagnóstico Etiológico de las Enfermedades Infecciosas

1- Introducción: La principal preocupación del microbiológico clínico es aislar e identificar con rapidez los microorganismos a partir de muestras clínicas. El objetivo del laboratorio de microbiología clínica es proporcionar al médico la información sobre la presencia o ausencia de microorganismos que pueden estar implicados en el proceso patológico infeccioso. Además de identificar los microorganismos también determinamos la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos. El diagnóstico puede realizarse mediante: 1-DETECCIÓN DEL AGENTE CAUSAL: Métodos microbiológicos. 2-BÚSQUEDA DE ANTICUERPOS: Métodos inmunológicos. Ventaja: rapidez, ya que los análisis microbiológicos como mínimo tardan 3 días. Aunque se realiza el método inmunológico siempre se realiza igual el método microbiológico. Hay un % de m.o. Que solo se hace x método inmunológico.

Método Microbiológico

Los pasos generales en este proceso son: -Toma de la muestra. -Examen microscópico: Directo-en fresco, Tinción. -Siembra de la muestra y resiembras para el aislamiento del microorganismo. -Identificación del germen. -Estudio de la sensibilidad antimicrobiana (antibiograma.

Toma de Muestra

Se denomina muestra en microbiología a una porción o cantidad del material humano que se va analizar, con el fin de determinar la presencia o ausencia de determinados microorganismos en la misma. Es importante tener en cuenta: 1- La muestra debe ser representativa (toma de muestra adecuada en condiciones adecuadas y la parte de la muestra más anormal) y en cantidad suficiente. 2- Hay que procurar obtenerla con la mayor asepsia posible para evitar la contaminación de la misma. 3- Debe trasladarse con rapidez al laboratorio. Se debe guardar en nevera, si vamos a tardar + tiempo utilizar medios de transporte. 4- Si es posible, se debe obtener la muestra antes de haber administrado antibióticos al paciente.

Examen Microscópico

Este examen puede darnos informaciones que nos ayudan a encauzar el análisis de una forma u otra. Este se puede realizar de la formas siguientes: Observaciones en fresco, Tinción de Gram: que dependiendo de la muestra nos dará una información muy útil. En muestras muy estériles no se hace, y en muestras en fresco tampoco se hace. Tanto la morfología como la afinidad tintorial me va ayudar a encaminar el análisis, pues habrá dividido a las bacterias en dos grupos por lo menos, gram positivas o negativas y cocos o bacilos, ya que un análisis a ciegas sería imposible. Según el grupo del que se trate procederemos a realizar unas pruebas u otras.

Siembras

Realización de siembras en distintos medios para el aislamiento de la bacteria. La elección de un medio u otro está en función del tipo de muestra y de lo obtenido en el examen en fresco. Generalmente existe un protocolo para cada tipo de muestra, ejemplo, para la orina se utiliza: -Medio Cled. -Medio MacConkey

Identificación Bacteriana

Se llevará a cabo de forma general siguiendo el esquema siguiente: Estudio de la morfología (bacilos-alargados cocos-redondos vidrios-forma de coma) (forma de la bacteria y agrupaciones estafilococica, forma de racimo estreptococica-en cadena de dos en dos-..) forma de m.o. Y agrupación. Afinidad tintorial (+ o -) (bacoterias gram+ o -). Necesidades nutritivas: según lo que los m.o utilizan en su nutrición, nosotros somos capaces de identificar. Capacidad metabólica a diversos substratos (Identificación bioquímica). Para poder diferenciar microorganismos, que microscópicamente poseen una morfología similar, tanto pertenecientes a uno o a distintos grupos, uno de los elementos a tener en cuenta son sus capacidades metabólicas para utilizar distintos substratos, los productos finales que pueden producir a partir de ellos. En la identificación bioquímica se pueden estudiar: -Sistemas enzimáticos respiratorios -Metabolismo Hidrocarbonado -Metabolismo Proteico -Metabolismo de ácidos nucléicos -Metabolismo lipídico. La identidad inicial de un microorganismo bacteriano puede ser sugerida por: 2.5 La procedencia de la muestra de cultivo 2.6 Su aspecto microscópico y la tinción de Gram 2.7 Su patrón de crecimiento en medios de cultivo selectivos, diferenciales, sus propiedades hemolíticas, metabólicas y la fermentación de diversos medios de cultivo. Después de examinar las anteriores características, se proceden a realizar las pruebas bioquímicas correspondiente en función de microorganismo o microorganismo del que se sospeche.

Estudio de la Sensibilidad Antimicrobiana: Antibiograma

Una vez identificado al germen, el laboratorio de microbiología debe ayudar al clínico en administrar el tratamiento más adecuado. Para ello se realizan estudios de la sensibilidad de los microorganismos a distintos agentes quimioterápicos. Los resultados nos puede mostrar cual de ellos es más efectivo contra ese agente.

Clasificación de las Bacterias

:A la hora de la clasificación bacteriana se tiene en cuenta una serie de parámetros que suelen ser los siguientes.1- TINCIÓN DE GRAM: que clasifica a las bacterias en dos grandes grupos atendiendo a la estructura de la pared bacteriana:- Gram positivas – Gram negativas.2- SEGÚN EL TIPO DE RESPIRACIÓN: a- Aerobias: son aquellas que para vivir necesitan la presencia de oxígeno en el aire.b- Aerobias y anaerobias facultativas: son las que pueden vivir en presencia de oxígeno y en ausencia del mismo.c- Anaerobias estrictas: son aquellas que no pueden vivir en presencia de oxígeno porque resulta tóxico para las mismas.d- Microaerófilas: precisa para su desarrollo de pequeñas cantidades de oxígeno dióxido de carbono(5% de oxígeno y un 10% de CO2).3- SEGÚN LA PRUEBA DE LA CATALASA:Detecta si la bacteria tiene el enzima capaz de descomponer el agua oxigenada, que producen en su metabolismo, transformándola en agua y oxígeno.4- SEGÚN LA PRUEBA DE LA OXIDASA:Detecta el enzima oxidasa. La finalidad de la prueba de la oxidasa es, determinar la presencia del enzima citocromo oxidasa que en presencia del aire actúa sobre ciertas aminas aromáticas y produce compuestos coloreados

TEMA 7:COCOS GRAM POSITIVOS:1.CLASIFICACIÓN:Nos encontramos con las familias siguientes:1- FAM. MICROCOCCACEAE.2- FAM. STREPTOCOCCACAE:Para diferenciar una famila de otra , realizamos las siguientes puebas:A- Morfología observada en la tinción de Gram:1- F. MICRO: Gram +, cocos redondos en racimos o tétradas.2- F. STR.: Gram + cocos elípticos agrupados en cadenas.B- Prueba catalasa:1- F. MICRO: catalasa + .2- F. STR.:catalasa – .C- Prueba de la oxidasa.1- F. MICRO: negativa. 2- F. STR.negativa.-.-.Permite diferenciar diplococos Gram negativos de la familia Neisseraceae que son oxidasa +.E- Morfología de la colonia:1- F. MICRO: colonias grandes. 2- F. STR.colonias pequeñas y grises.PRUEBA DE LA CATALASA:FUNDAMENTO:La catalasa es un enzima que actúa descomponiendo el peróxido de hidrógeno, producto final de la degradación aeróbica de los hidratos de carbono, por lo tanto se encuentra presente en la mayoría de MO aeróbicos y anaeróbicos facultativos.Entre sus aplicaciones se encuentra la diferenciación de:__Streptococcus (-) del Micrococcus y del Staphylococcus que son +. __Bacillus (+) del Clostridium (-).__Listeria monocytogenes (+) del Erysipelotrix (-).TÉCNICA:Se basa en poner en contacto el MO con una gota del peróxido de hidrógeno sobre un porta, si este posee la catalasa lo descompone en H2O y O2.RESULTADO:Catalasa + : formación inmediata de burbujas.Catalasa – : no aparecen burbujas.2- FAMILIA MICROCOCCACEAE.2-1.CARACTERÍSTICAS:Inmóviles->aerobios->G.MICROCOCCUS.anaerobios facultativos ->G.STAPHYLOCOCCUS.Móviles-> G..PLANOCOCCUS:Poseen importancia terapéutica los géneros:– Micrococcus: colonias amarillas, se agrupan en tétradas, son sensibles a la bacitracina. Son parte de la flora normal.– Staphylococcus: colonias amarillas, se agrupan en racimos, son resistentes a la bacitracina.Se diferencian:Familia Micrococcace.-Prueba de la bacitracina.Resistentes->G.STAPHYLOCOCCUS.Sensibles->G.MICROCOCCUS.2.2.-G.STAPHYLOCOCCUS:1–CARACTERÍSTICAS:_Cocos grandes y redondos, se agrupan en racimos. Gram +.__Anaerobios facultativos.__Catalasa + y oxidasa -.__Resistentes a la bacitracina.__Se desarrollan en medio manitol salado (Agar Chapman)medio diferencial xq diferencia +de-,medio enriquecido ,y selectivo.-.-.-.-.Colonizan piel, mucosas, fosas nasales y con menor frecuencia el intestino del hombre.-.-.-.Su poder patógeno está relacionado con la capacidad de coagular el plasma (patógeno coagulasa +).-.-.-.-.-. 0,5 a 1,5 micrometro de diametro. -10%sal.-35 especies e 17 sub-especies .-Colonias doradas,rosas.
Medio chapman = medio manitol salado.Componentes estructurales:_capsula__pared cel(peptidoglicano)__proteina A__acido eicoico__membrana plasmatica.2- PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN:1- Prueba de la coagulasa:La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. Los Staphylococcus aureus patógenos dan una reacción postiva y los no patógenos->negativa.-.-.Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación a las 4 y 24h sin sacarlos de la estufa.-.-.-.Se puede realizar en porta y en tubo. En porta es+ rapida. Se pone plasma en contacto con el m.o.si da -, hay que hacerla en tubo para confirmar la negatividad.se confirma la neg. A las 24h.+->coagulacion2- Prueba de la DNAasa:Se utiliza para diferenciar los m.o basados en la act de desoxirribonucleasa (DNAsa)el alto nivel de acido desoxirribonucleico molecular hace oisible la detecion dela Dnasa q despolimeriza el ADN..-.-Despues de la incubacion del medio con la cepa de prueba,la placa se inunda con acido clorhidico,q causa la precipitacion del ADN polimerizado y hace al medio opaco.los organismos.-.-.-.-.Prueba confirmativa s. aureus.
Siembra en medio base q tiene ADN.Se deja incubando pero a als 24h no se vee nadarealiza revelado ->añadir Hcl.-..-ADNSA+ ->degrada el adADN- zona oscura no degradada.-.-.Detecta la producción de la Desoxirribonucleasa en bacterias capaces de sintetizarlas.3-Prueba sensibilidad a la novobiocina:diferencia S epidermidis de saprophytius.CRECIMIENTO EN PLACA DE MANITOL SALADO (MEDIO CHAD-MAN)? SOSPECHA DE GENERO ESTAFILOCOCUS.__-.-.se toma un medio base en el cual el medio crezca (agar tripticasa soja o mueller hinton).-.hacemos una siembra de ese m.o .hacer estrias muy muy untas para q se vea mejor el crecimiento.4- Capacidad de fermentar el manitol y desarrollo en medios de alto contenido en cloruro sódico:Siembro en manitol salado, en el que solo crecen las bacterias halófilas (staphylococos y poco más).
Manitol salado-> medio selectivo, diferencial(diferencia manitol + de los m. o , q son manitol neg.El medio es rojo y posee el indicador rojo fenol, las bacterias capaces de fermentar el manitol producen ácidos que hacen virar el medio a amarillo.
S. aureus coagulasa + DNAasa+ Noboviacina sensible manitol  Amarillo S. epidermidis: coagulasa-   DNAasa- Noboviacina sensible    S. saprophyticus – – resistente

 2.PATOLOGÍA:1-S.aureus:El S. aureus constituye el principal patógeno dentro del grupo de los estafilococos.Factores de patogenicidad:1)Enzimas: Catalasa__Hialuronidasa__Beta lactamasas __Nucleasas__Lipasas__coagulasa__hialuronidasa__fibrinolisina(estafiloquinasasA)__penicilinasas.2)Toxinas:Alfa-toxina(ataca la membrana de los eritrocitos, es dermonecrótica)__Beta toxina (degrada la esfingomielina)__Gamma toxina (lisa los eritrocitos)__Delta toxina ( Se la asocia en la diarrea aguda)__Toxina exfoliativa ( engloba 2 toxinas implicadas en el síndrome de la piel escaldada).-.-.-.Aproximadamente la mitad de las cepas producen enterotoxinas responsables de un número importante de intoxicaciones alimentarias.__hemolisinas a (hemolisis parcial),hemolisinas b (total,te lisa 100% los hemaies),hemolisinas gamma(tan peque q en el laboratorio casi no se vee.__Colonias beta y alfa hemoliticas:alfa son blanquecinas o verdeci,y en las betason mas transparetnes.__enterotoxinas(vomitos,diarreas)__toxina(sindrome del shock toxico).-.-.exotoxinas-toxinas q en cualquier momento ese microorganismo las despide al medio.xq es producto desu metabolizacion.endotoxinas.se despiden al medio cuando el m.o muere.
3)Estructura antigénica:__Peptidoglicano (Induce la producción de Ac opsonizantes por los monocitos, atrae leucocitos polimorfonucleares, activa el complemento y posee actividad endotóxica).__Proteina A ( Es capaz de anclarse a la región Fc de las Ig G humanas y activar el complemento)__Factor de aglutinación o coagulasa unida (Fija el fibrinógeno)__Cápsula polisacárida ( Inhibe la fagocitosis por los leucocitos polimorfonucleares).Infecciones causadas por el S. aureus– Infecciones de la piel, son las más habituales, como:__Celulitis__Pústulas__Forúnculos__Carbuncos__Impétigos
–Infecciones generalizadas:__Bacteriemias y sepsis(infeccion en sangre__Endocarditis__Meningitis__Neumonía__Osteomielitis__artritis__sindrome del shock-toxico:caracterizado por fiebre, erupción descamativa de la piel, hipotensión y afectación multisistémica (Asociada a la utilización de tampones).__Intoxicaciones alimentarias por ingestión de las toxinas preformadas.Identificación:Hemólisis en agar sangre de cordero.Fermentación de Manitol produciendo ácidos.Pigmentación dorada (aureus)- es frecuente.Coagulasa-positiva.Dnasa positiva.Sistemas comerciales de identificación:Existen en el mercado una gran variedad de sistemas de identificación, basados en pruebas bioquímicas, enzimáticas y de sensibilidad.-.-.-.Los sistemas API Staph-Ident y ATB 32 Staph consisten en tiras con microcúpulas que contienen sustratos deshidratados a los que se inocula una suspensión de MO.-.-.-.Los sistemas automatizados Microscan y Pasco emplean placas de microtiter en las que se inocula el MO.—identificacion estafilococos:__prueba de catasa__de la coagulasa__test de DNAasa__prueba novobiocina__biologia molecular.2-S. epidermidis:
Factores de patogenicidad:Algunas cepas produen una toxina similar a la elta toxina del S.aureus, que ha sido relacionada con la enteroolitis neonatal necrotizante.-.-.Pueden producir un exopolisacárido llamado Slime, responsable de la resistencia a la fagocitosis y del fracaso de la terapéutica antimicrobiana.Infecciones que produce:Responsable de infecciones oportunistas y nosocomiales como:__Bacteriemias __Peritonitis asociada a diálisis__Osteomielitis__Infecciones de tracto urinario__Infecciones de catéteres.Identificación:Su crecimiento no provoca hemólisis en agar sangre de cordero.__No fermenta Manitol__No es pigmentado__Coagulasa -negativo.3.-S saprophyticus:Novobiocina->resistente,da s.saproph.Este organismo es una causa significativa de infecciones del tracto urinario. Es también coagulasa negativo y normalmente no es posible diferenciarlo clínicamente de S. epidermidis.