Tipos de técnicas de tinción en histología

Hay cuatro tipos de técnicas de tinción en la histología:  IMPORTANTE DIFERENCIAS.  

No químicas

Las sustancias utilizadas no son químicas. Por ejemplo: se pueden usar metales para impregnar tejidos, como en la microscopía electrónica o el Sudán IV.

Histoquímicas

Se usan productos químicos, que se unen a ciertas sustancias y estructuras para poder diferenciarlas en la microscopía óptica.  Por ejemplo: la tinción hematoxilina-eosina.

Enzimohistoquímicas

Se usan sustancias que al procesarse por una enzima adquieren color, y por lo tanto no tiñen el tejido en sí, sino que sirven para determinar la acción enzimática de un tejido. Si la enzima funciona bien la cosa se tiñe, sino, no se tiñe. 

Inmunohistoquímicas

Se utilizan anticuerpos marcados (se les pega una sustancia para que tengan color) para detectar sustancias presentes en la célula de manera muy específica. Por las propiedades de los anticuerpos, un anticuerpo sólo se puede unir a una sustancia específica (reacción antígeno-anticuerpo).

Técnicas para visualizar sustancias: TEJIDO ADIPOSO

Dos tipos de lípidos

Los homofasicos, grasas puras, en vesículas grasas de los adipocitos, y se suelen teñir con Sudan IV u Oil red O. Los heterofasicos, son grasas unidas a otras moléculas; glucolípidos, dispersos por los tejidos y las células, como en las membranas celulares.   ii) Procesamiento del tejido adiposo.Los lípidos son insolubles en agua pero solubles en otras muchas sustancias. Cortar órgano →OCT →criostato (7-10) →descongelar →fijar en formol cálcico (10%-1%)→papel de aluminio → reñir con disoluciones alcohólicas (agitar para que no se precipite) → lavar con alcohol o isopropanol →hematoxilina para dar contraste →montaje en medio acuoso iii) Tinciones no histoquímicas más usadas para lípidos: 

Sudán IV y Oil Red

Lípido de rojo-naranja,  se usa en cortes en congelación. 

Sudán Negro

Lipidos y mielina de negro, los nucleos o citoplasma de rojo. 

Azul de Nilo (método de Lillie)

Grasas ácidas ( azul por el azul nilo) y las grasas neutras (rosa-rojo por el rojo nilo) Se usa en fluorescencia.

Tinciones para los carbohidratos

Son moléculas orgánicas, formadas por HCO; el que más se tiñe es el glucógeno, que es una cadena larga formada por moléculas de glucosa. Hígado.

ii) Procesamiento de los carbohidratos.

Son solubles en agua, y a la hora de teñirlos no se pueden usar colorantes en soluciones acuosas. Para la fijación se suelen usar etanol al 80%, líquido de carnoy o bouin ácido. Y se sigue el procesamiento normal hasta la desparafinación. Importante: después de desparafinar se usa un líquido llamado COLODIONADO, es un alcohol-éter que reacciona con el glucógeno haciendo insoluble pero permite la tinción. 

Se utilizan para la detección de tumores con glucógeno como sarcoma de Ewing o tumores renales, enf. de glomérulo del riñón, enf. hepáticas, adenocarcinomas o infecciones por hongos. 

iii) Tinciones más usadas:

Carmín Best (No histoquímica): Es una coloración regresiva que tiñe el glucogeno de color rosa. Primero se tile con hematoxilina y se lava en agua corriente, luego se aplica el carmín best durante 30 minutos y se diferencia con una mezcla de metanol y etanol. Finalmente se deshidrata con alcohol absoluto, xilol y se monta. Se suele usar en biopsias de endometrio, además es necesario usar controles ya que no es totalmente específica y puede teñir otras sustancias. 

PAS (ácido periódico Schiff): Es una tinción histoquímica que tiñe los CH de rojo oscuro, magenta. El PAS tiñe un montón de tipos de carbohidratos, que se clasifican en dos tipos: los PAS + (mucopolisacáridos simples (glucógeno y celulosa) y mucopolisacáridos neutros…) y los PAS – (mucopolisacáridos ácidos). El mecanismo de tinción consiste en la oxidación de los tejidos para incrementar el número de grupos carbonilo. Luego el colorante se unirá a estos grupos por una reacción química. El protocolo de tinción es el siguiente: Desparafinar, hidratar; Ácido peryódico 0,5%; agua destilada; Reactivo de Schiff (fucsina básica modificada); 3 lavados en baño de ácido sulfuroso; agua corriente ; Hx; Agua corriente; Agua destilada .

Mucicarmín o Carmín de Mayer: Sirve para detectar mucinas, que son unas secreciones creadas por las células epiteliales y el tejido conjuntivo,  se usa para adenocarcinomas e infecciones de hongos encapsulados (Cryptococcus).  Es posible gracias a que el mucicarmín tiene carga positiva y estos monosacáridos tienen carga negativa. 

Hierro coloidal: el hierro se une a los monosacáridos ácidos por las cargas y luego se usa azul de Perls o de prusia que tiñe el hierro. Patología: biopsias de médula ósea y carcinoma renal.

El PAS se puede combinar con otras técnicas para alterar lo que vemos: 

PAS-diastasa: la diastasa rompe el glucógeno y se colorean el resto de hidratos de carbono. 

Azul alcián: Tiñe de azul los mucopolisacáridos ácidos.Se usan en kits con rojo nuclear para contrastar los núcleos en rojo y citoplasmas en rosa.  

Azul alcián-PAS: al usarse los dos colorantes se pueden diferenciar los mucopolisacáridos ácidos de azul, mucopolisacáridos neutros y glicoproteínas de rojo y el resto morado si se usa hematoxilina.

COLORACIONES PARA LAS PROTEÍNAS Y ÁCIDOS NUCLÉICOS.

Para la fijación de proteínas no se recomiendan fijadores precipitantes o deshidratantes, pero aun así se sigue empleando el formol. Para los ácidos nucleicos se usa el sublimado, formol o Bouin, pero JAMÁS se usarán etanol, tricloroacético o dicromato.

i) Tinciones para la fibrina:  La fibrina es una proteína que se crea en la cascada de coagulación, esta forma el coágulo de sangre y se crea cuando el fibrinógeno se polimeriza. En algunas patologías se puede encontrar en las paredes de los vasos sanguíneos (“fibrinoide”).  Para su tinción se usa la hematoxilina férrica o  de Weigert, que tiñe la fibrina de azul. Sin embargo este método es inespecífico y puede teñir otras sustancias.

ii) Tinciones para la proteína amiloide:  En algunas patologías se produce un trastorno del metabolismo de proteínas y se produce el depósito extracelular de un material proteico fibrilar amiloide. AMILOIDOSIS. Se usa el rojo congo tiñe de rojo-rosa la sustancia amiloide. Se puede usar junto con una tinción nuclear.

iii) Tinciones para los ácidos nucleicos: La tinción del ADN permite conocer la cantidad de ADN que tienen las células, diferenciando las fases del ciclo celular o fases de la división celular. Una de las tinciones es la tinción de feulgen que tiñe de rojo-púrpura el ADN. Otro ácido nucleico es el ARN, al teñir el ARN podemos diferenciar las células con gran producción de proteínas, ya que son ricas en ARN ribosómico. Por ejemplo: la tinción de Verde metilo-pironina: Tiñe de verde el ADN (núcleo) y de rojo el ARN en el citoplasma. (Tinción no histoquímica).

iv) Tinciones para la melanina: Fontana-Masson: Tiñe la melanina, los gránulos argentafines y cromafines de negro. Básicamente se usa para los tumores, como los melanomas o neuroendocrinos. 

v) Tinciones para iones:  Se usa el azul de perls para ver el hierro en cualquiera de sus formas; y para observar el calcio en lesiones óseas se usa la Tinción Von Kossa: Tiñe el calcio negro.

TÉCNICAS PARA VISUALIZAR TEJIDOS O CÉLULAS:

1- PARA VER CÉLULAS SUELTAS: 

i) Azul de Toluidina:   tinción metacromática, es decir, cuando el líquido interactúa con el tejido o las células cambia de color, el color original no es el mismo que cuando tiñe. Las estructuras que provocan este cambio se llaman cromótopos.   Cuando el azul de toluidina interactúa con los  mastocitos, mucopolisacáridos ácidos, ácidos nucleicos o lípidos ácidos adquiere una gama desde el verde brillante hasta el púrpura. Los baños en etanol inhiben la metacromasia. 

ii) Giemsa:  Se usa normalmente en sangre, y sus componentes principales son la eosina y el azul de metileno (también están los componentes de la oxidación del azul). 

2- TINCIÓN PARA EL TEJIDO CONJUNTIVO: El tejido conjuntivo de soporte y junta a otros tejidos y está formado  por fibras de colágeno sintetizadas por los fibroblastos. Para teñir las fibras de colágeno se usa Tricrómico de Masson. Las fibras elásticas se verán de  burdeos y castaño oscuro, mientras que las demás estructuras tisulares se tiñen de color marrón pálido.

3- TEJIDO NERVIOSO: en este punto o te ríes o lloras. 

i) Coloraciones NO argentinas: no usan metales

Coloraciones para neuronas o grumos de Nissl: Los grumos de Nissl son acumulaciones de retículo endoplasmático rugoso pegadas al núcleo de la neurona. Se usarán colorantes básicos de anilina como el violeta de cresilo (cresil violeta). Tiñe los grumos de Nissl y núcleos de violeta, células nerviosas de azul tenue. Si están las células nerviosas teñidas de azul tenue pero los grumos no están teñidos significa que no hay actividad metabólica en la neurona, es decir la célula está muerta, hay daño neuronal.

Coloraciones para glia: Dan apoyo, nutren defienden a las neuronas. La tinción más usada es la hematoxilina ácida fosfotúngstica o PTAH, que se usa principalmente para identificar los astrocitos, sobre todo en las patologías relacionadas con ellos. Tiñe neurofibrillas y miofibrillas de azul negruzco, axones de azul pálido a negro, colágeno de rojo y astrocitos de rojo pálido.  

Coloraciones para vaina de mielina: La mielina son grasas que recubren el axión de la neurona y mejoran la transmisión del impulso nervioso. El más usado es  Luxol fast blue, que es insoluble en agua pero soluble en grasas y tiñe las vaina de mielina de azul o verde-azulado y las neuronas y grumos de Nissl de violeta.

ii) Impregnación metálica: En la impregnación se usan iones de metales que se enlazan al tejido y precipitan aportando color, las neuronas se ven negras-opacas, su principal desventaja es que no permiten ver el interior de la célula y que son carísimos porque se usan sales de plata. Ejemplos de impregnaciones: Solución de nitrato de plata. Complejos amonio argénticos, Solución de proteinato de plata (protargol).